Алиев. Современные клеточные технологии в медицине - файл n1.doc

Алиев. Современные клеточные технологии в медицине
скачать (1468 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc1468kb.21.10.2012 09:57скачать

n1.doc

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
1. Трансплантация (ТП) клеток в миокард с целью привнести клетки, которые могут заместить недостаток сократительных элементов в сердечной мыпще. С 1995 г. в научной литературе стали появляться публикации, ю

описывающие на экспериментальных моделях положительный эффект трансплантированных в миокард клеток, призванных активно участвовать в систоле сердца: эмбриональных кардиомиоцитов [10—-^ь скелетных миобластов [13-15] дладкомьшечных клеток [16,17], преди(рФеРенциРованнь1Х в кардаомиогенном направлении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [18,19], ген-модифицированных клеток [20].

  1. Трансплантация клеток с целью стимулировать репаративные процессы в миокарде. Возможность с помощью метода клеточной ТП дооиться умень­шения размеров постинфарктного рубца, уменьшить образование постин­фарктной аневризмы показана в экспериментальных работах [II, 1», II, Ну Показано, что улучшаются эластические свойства рубца: он становится менее ригидным, улучшая кровенаполнение ЛЖ в диастолу, и меньше мешает полноценной систоле; уменьшает интенсивность рубцевание (это предотвра­щает экспансию рубцовой ткани) и размеры рубца. Клеточная ш способство­вала также профилактике дилатации левого желудочка.

  2. Трансплантация клеток с целью стимулировать рост новых сосудов для ликвидации ишемии миокарда (неоангиогенез). Интерес исследователей к сти­муляции развития новых кровеносных сосудов в миокарде значительно вырос в последние годы. Рост новых сосудов—так называемый неоангиогенез—это процесс, который может компенсировать дефицит гемоперфузии ишеми-зированных областей. Неоангиогенез может быть реализован путем введения различных факторовроста, генной терапией, а также трансплантацией клеток-предшественников сосудистого эндотелия и клеток, принимающих участие в регуляции роста капиллярных сетей. По нашему мнению, именно метод клеточной ТП является наиболее перспективным в стимуляции роста новых сосудов.

В экспериментах по пересадке клеточного материала в миокард удалось относительно подробно описать структурные перестройки в сердечной мышце после трансплантации, и эта информация позволяет обсу*дать несколько эффектов.

Известно, что привнесенные в миокард клетки выделяют различные биоактивные вещества: ростовые факторы, цитокины и Др- исооенно это касается стволовых клеток, основные эффекты от имплантации которых выражаются в мощной индукции репаративных процессов в месте повреждения [11,23]. В то же времямикроокружение, в которое попадают введенные клетки, также оказывает влияние на их развитие. Так, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) под влиянием микроокружения развиваются в фенотип КМЦ [13, 23, 24], однако механизмы и сигналы такой трансформаш™ пока не расшифрованы.

Пересадку клеток в миокард можно использовать для ограничения роста зоны ИМ, улучшения механических свойств рубцово-измененнои мышцы сердца, улучшения васкуляризации миокарда. Используемые для этих целей клетки должны прежде всего длительно выделять биологически активные вещества и уменьшать степень фиброза миокарда. Трансплантированные клетки могут обладать антиапоптотическим действием, усиливать ангиогенез, улучшать сократимость миокарда и предотвращать его ишемию.

и

недифференцированных клеток, экспрессирующих антигены стволовых клеток, и для различения примитивных клеток реципиента и полученных от донора может быть использована Y- хромосома.

Исследователи ищут достаточно простой способ, чтобы помочь восстановлению функции поврежденных в результате химиотерапии сердец; это встречается у 10% больных раком после лечения химиопрепаратами. СК, как известно, восстанавливают поврежденные сердца. В опытах на мышах человеческие СК могут превращаться в два вида клеток, способных восстановить функцию сердца: клетки сердечной мышцы, за счет которых сердце сокращается, и эндотелиальные клетки, которые равномерно распределены по всему органу, образуя кровеносные сосуды. В одном исследовании спустя два месяца после трансплантации человеческих стволовых клеток мышам с пораженными сердцами приблизительно в 2% клеток в сердцах реципиентов обнаруживался человеческий генетический маркер (Zhang et al., 2004). Человеческие СК в основном сливаются с мышиными кардиомиоцитами, в результате образуются новые мышечные клетки, которые содержат и человеческую, и мышиную ДНК. Но чтобы сформировать новые клетки кровеносных сосудов, они, по-видимому, дифференцируются сами, замещая поврежденные мышиные кровеносные сосуды человеческими клетками. Эти открытия должны помочь разрешить споры относительно того, создает ли трансплантация СК новые типы клеток, которые пересаживают в сердце.

Обоснование терапевтических эффектов трансплантации клеток требует, прежде всего, доказательств присутствия клеток в зоне трансплантации. Для этого в НИИТиИО (Москва) был использован генно-инженерный метод доставки в клетки in vitro рекомбинантного делецированного аденовируса, в составе генома которого присутствует ген Lac-Z из Е Coli. Ген Lac-Z кодирует фермент р-галактозидазу, наличие которого выявлялось при добавлении субстрата X-Gal. С помощью этого генно-инженерного метода в опытах на животных были получены доказательства того, что аутологичные прекульти-вированные клетки, введенные в миокард, сохраняют свою жизнеспособность и выявляются в зоне трансплантации по крайней мере в течение 30 суток. При повреждении сердец и трансплантации в принекротическую зону левого желудочка клеток было установлено, что показатели эффективности восстановления насосной функции сердца при интрамиокардиальном введении предифференцированных кардиомиоцитоподобных клеток костного мозга не уступали показателям работы сердца при использовании фетальных кардио-миоцитов. Такой вывод был сделан на основании результатов сравнительного исследования аортального, ударного и минутного объемов сердца в условиях применения дозированных нагрузок с объемом и сопротивлением в стендовой установке по Neely (Потапов и др., 2003).

Метод клеточной трансплантации в настоящее время считается наиболее перспективным для стимуляции регенерационно-репаративных процессов в миокарде. Выделяют три основных подхода к решению данной задачи:

1. Трансплантация (ТП) клеток в миокард с целью привнести клетки, которые могут заместить недостаток сократительных элементов в сердечной мышце. С 1995 г. в научной литературе стали появляться публикации,

ю

описывающие на экспериментальных моделях положительный эффект трансплантированных в миокард клеток, призванных активно участвовать в систоле сердца: эмбриональных кардиомиоцитов [10—12], скелетных миобластов [13—15], гладкомышечных клеток [16,17], предифференцированных в кардиомиогенном направлении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [18,19], ген-модифицированных клеток [20].

  1. Трансплантация клеток с целью стимулировать репаративные процессы в миокарде. Возможность с помощью метода клеточной ТП добиться умень­шения размеров постинфарктного рубца, уменьшить образование постин­фарктной аневризмы показана в экспериментальных работах [11,18,21,22]. Показано, что улучшаются эластические свойства рубца: он становится менее ригидным, улучшая кровенаполнение ЛЖ в диастолу, и меньше мешает полноценной систоле; уменьшает интенсивность рубцевания (это предотвра­щает экспансию рубцовой ткани) и размеры рубца. Клеточная ТП способство­вала также профилактике дилатации левого желудочка.

  2. Трансплантация клеток с целью стимулировать рост новых сосудов для ликвидации ишемии миокарда (неоангиогенез). Интерес исследователей к сти­муляции развития новых кровеносных сосудов в миокарде значительно вырос в последние годы. Рост новых сосудов—так называемый неоангиогенез — это процесс, который может компенсировать дефицит гемоперфузии ишеми-зированных областей. Неоангиогенез может быть реализован путем введения различных факторов роста, генной терапией, а также трансплантацией клеток-предшественников сосудистого эндотелия и клеток, принимающих участие в регуляции роста капиллярных сетей. По нашему мнению, именно метод клеточной ТП является наиболее перспективным в стимуляции роста новых сосудов.

В экспериментах по пересадке клеточного материала в миокард удалось относительно подробно описать структурные перестройки в сердечной мышце после трансплантации, и эта информация позволяет обсуждать несколько эффектов.

Известно, что привнесенные в миокард клетки выделяют различные биоактивные вещества: ростовые факторы, цитокины и др. Особенно это касается стволовых клеток, основные эффекты от имплантации которых выражаются в мощной индукции репаративных процессов в месте повреждения [11,23]. В то же время микроокружение, в которое попадают введенные клетки, также оказывает влияние на их развитие. Так, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) под влиянием микроокружения развиваются в фенотип КМЦ [13, 23, 24], однако механизмы и сигналы такой трансформации пока не расшифрованы.

Пересадку клеток в миокард можно использовать для ограничения роста зоны ИМ, улучшения механических свойств рубцово-измененной мышцы сердца, улучшения васкуляризации миокарда. Используемые для этих целей клетки должны прежде всего длительно выделять биологически активные вещества и уменьшать степень фиброза миокарда. Трансплантированные клетки могут обладать антиапоптотическим действием, усиливать ангиогенез, улучшать сократимость миокарда и предотвращать его ишемию.

11

Однако обнадеживающие результаты экспериментальных исследований не всегда могут быть экстраполированы на человека. Например, было показано, что мобилизация стволовых клеток костного мозга с помощью гранулоци-тарно-колониестимулирующего фактора дает возможность стволовым клеткам костного мозга (КМ), используя эффект "хоуминга", восстанавливать функцию поврежденного сердца [25]. Однако клинические испытания этого нового метода не подтвердили эффективность такого подхода. Использование аллогенных фетальных КМЦ в клинической практике ограничено по этическим соображениям и из-за необходимости использовать иммуносупрессию, которая к тому же не гарантирует длительного приживания пересаженного материала.

Но все же накопленный экспериментальный материал позволил перейти к первым клиническим исследованиям. Выбор клеточного материала для трансплантации кардиологическим больным исключает в настоящее время использование аллогенного и ксеногенного материала. Фетальные клетки не могут быть использованы в связи с наличием этических проблем при их исполь­зовании и необходимостью применения иммуносупрессантов. Применение взрослых аллогенных клеток ограничено из-за недостаточной изученности иммунологических реакций, которые протекают после введения, например, мезенхимальных стволовых клеток. Поэтому наиболее приемлемым источ­ником является аутологичный костный мозг, в котором имеется значительное количество стволовых гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток (ГСКиМСК).

Ранее в экспериментах на животных было доказано, что ГСК обладают свойством пластичности, обеспечивающим им трансдифференцировку в кардиомиогенном направлении при попадании в специфическое микроокру­жение [25—28]. Однако рядом авторов это утверждение было опровергнуто: была показана возможность слияния ГСК со взрослыми кардиомиоцитами и образования химерных клеток; при этом у исследователя создается впечатление, что ГСК трансдифференцируются в кардиомиоциты [29,30].

Возможность дифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоциты после обработки клеток in vitro 5-азацитидином подтверждается многими авторами [18, 24, 31, 32]. Кроме того, применение клеток КМ достоверно улучшает перфузию миокарда путем стимуляции неоангиогенеза [33—37]. Важнейшим свойством СК КМ является секреция биологически активных веществ, обладающих антиапоптотическим и ангиогенетическим эффектом [38—40]. Также из костного мозга можно получить фракции клеток с выраженным свойством стимулировать неоангиогенез и активно участвовать в росте новых сосудов — так называемых эндотелиальных прогениторных клеток. Экспериментальные [48—50] и клинические [47] исследования показали высокую эффективность применения этих клеток.

Можно заключить, что применение СК КМ в терапевтических целях сможет предотвращать развитие инфаркта миокарда, прогрессирование ИБС и хронической сердечной недостаточности путем стимуляции неоангиогенеза и развития коллатерального кровоснабжения в миокарде.

В настоящее время полагают, что СК КМ могут влиять на восстановление функции миокарда несколькими путями:

12

1) стимулировать неоангиогенез и развитие коллатерального кровотока в

миокарде;

  1. увеличивать количество сократительных и/или проводниковых кле­точных элементов в миокарде за счет трансдифференцировки СК КМ и/или их слияния (fusion);

  2. секретировать цитокины, которые оказывают терапевтическое воздействие на структуру и функцию миокарда.

Таким образом, костный мозг взрослых людей содержит кроме ГСК и попу­ляции СК, которые являются эндотелиальными клетками-предшественниками, фенотипически и функционально сходными с эмбриональными геман-гиобластами. Они могут использоваться для непосредственной индукции формирования новых кровеносных сосудов в инфарктной зоне (васкулогенез) и развития уже существующей сосудистой сети (ангиогенез) после экспериментального инфаркта миокарда.

Изолированные из эмбриональных сосудов или культивируемые эндоте-лиальные клетки при сокультивировании с кардиомиоцитами новорожденных крыс или при введении во взрослое мышиное сердце после ишемии дифференцируются в сокращающиеся кардиомиоциты и экспрессируют специфические сердечные маркеры (Condorelli et al., 2001).

Человеческие эндотелиальные клетки пупочного канатика в подобных экспериментальных условиях также дифференцируются в кардиомиоциты и преходяще ко-экспрессируют фактор Виллебранда и саркомерный миозин.

Напротив, нейральные стволовые клетки, которые достаточно неплохо дифференцируются в фенотип скелетной мышцы, в кардиомиоциты дифференцируются в низком проценте случаев. Фактор роста фибробластов и костного морфогенетического белка (bone morphogenetic protein), которые активируют кардиомиогенную дифференцировку в эмбриональных клетках, не активируют кардиогенез в эндотелиальных клетках и трансдифференцировку в ко-культуре, что доказывает, что за развитие сердца в эмбриогенезе и в более поздние периоды отвечают различные сигнальные молекулы. Тот факт, что эндотелиальные клетки могут превращаться в кардиомиоциты, проливает новый свет на свойство пластичности эндотелиальных клеток в течение развития и открывает перспективы для заместительной терапии аутологич-ными клетками при инфаркте миокарда.

Сосудистый эндотелиальный ростовой фактор—vascular endothelial growth factor (VEGF) — стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток и индуцирует развитие кровеносных сосудов in vivo. Генная терапия при ишемии миокарда была выполнена прямым введением в миокард гена, кодирующего VEGF. Команда ученых из Yamagata University School of Medicine (Yamagata City, Japan) трансплантировала клетки Н9С2, трансфецированные геном VEGF, в инфарцированный миокард крыс. Через две недели крыс забивали и проводили морфологические исследования ткани миокарда. С помощью маркерных моноклональных антител в инфарктном миокарде была показана обильная неоваскуляризация вокруг трансплантированных клеток. Исследователи заключили, что клетки Н9С2, генетически модифицировавшие геном VEGF и затем пересаженные в поврежденные сердца крыс, переживают

13

и создают новые зоны роста сосудов. Эта методика может быть пригодной для клинического использования в будущем.

Неоангиогенез приводит к снижению апоптоза гипертрофированных миоцитов в периинфарктной зоне, длительному сохранению жизнеспособного миокарда, сокращению коллагенообразования и существенному улучшению сердечной функции. Использование человеческих цитокин-мобилизованных аутологичных костномозговых ангиобластов для реваскуляризации инфарцированного миокарда (в качестве монотерапии или в сочетании с другими современными методами лечения) может значительно уменьшить осложнения и летальность, связанные с ремоделированием левого желудочка.

Клинические данные о терапевтической эффективности доставки в принекротическую зону гемопоэтических стволовых клеток аутологичного костного мозга, как правило, не сопровождаются убедительными доказатель­ствами присутствия введенных клеток в зоне повреждения миокарда. Целью проведенного в НИИТиИО (Москва) исследования было определение месторасположения стволовых клеток костного мозга, доставленных в миокард больных ИБС интракоронарным или интрамуральным способом. Исследование выполнено у трех больных ИБС, перенесших один инфаркт миокарда и более. Интракоронарное введение стволовых клеток провели двум больным, а одному больному — интрамиокардиальную трансплантацию стволовых клеток обкалыванием зоны повреждения во время операции на открытом сердце. Для визуализации местоположения стволовых клеток в сердце аутологичные культивированные клетки костного мозга предварительно в течение одних суток метили в растворе таллия-201 (201Т1). Было показано, что при интра-миокардиальном и интракоронарном введении стволовых клеток достигается их преимущественная локализация в зоне повреждения. При этом создаются условия не только для более эффективного воздействия введенных клеток на патологические процессы в миокарде, но и условия для снижения каких-либо побочных генерализованных воздействий на организм в целом. Отсутствие очагов накопления таллия вне зоны введения—как в пределах миокарда, так и в печени — свидетельствует о том, что клетки при обоих вариантах введения остаются только в зоне введения. Более того, у обоих пациентов, которым за три недели до интракоронарного введения был восстановлен просвет коронарных артерий в бассейне перенесенного инфаркта миокарда, вводимые клетки распределились именно в зоне гипоперфузии — зоне перенесенного инфаркта миокарда. В бассейне правой коронарной артерии, впрочем, как и в печени, никаких очагов накопления таллия-201 отмечено не было. Однако ответить на вопрос о том, как долго живут и функционируют эти клетки после их введения, использованный метод не позволяет. Поэтому результаты долгосрочного влияния вводимых аутологичных стволовых клеток радионук-лидными методами можно оценить лишь опосредованно, изучая изменения перфузии, функции и метаболизма миокарда (Остроумов и др., 2004).

В экспериментальных исследованиях и клинических наблюдениях убедительно показаны стимуляция регенерации миокарда и неоваскулогенез при трансплантации мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга, содержащих около 2% гемопоэтических и 0,05% мезенхимальных стволовых

14

клеток (Шумаков и др., 2005). Одной из перспективных стратегий, которые смогут компенсировать дефицит гемоперфузии ишемизированных областей сердца после инфаркта миокарда, является неоангиогенез, а именно стимуляция развития новых кровеносных сосудов. Целью проведенной в НИИТиИО (Москва) работы явилось изучение влияния стромальных и продифференци­рованных в эндотелиальном направлении клеток аутологичного костного мозга на стимуляцию роста новых сосудов в поврежденном миокарде. Подсчет количества сосудов в контрольной группе (без введения клеток) и в двух экспериментальных группах после ТП клеток показал достоверное увеличение количества сосудов в обеих экспериментальных группах (Потапов и др., 2005).

Ученые в Ростокском университете (University of Rostock, Германия) трансплантировали аутологичные стволовые клетки костного мозга в инфаркт­ную пограничную зону шести пациентам, которые перенесли инфаркт миокарда и шунтирование коронарной артерии (Stamm et al., 2003). Все пациенты выжили и хорошо себя чувствовали спустя 3 и 9 месяцев после операции. У четырех пациентов улучшилась функция левого желудочка, у пяти пациентов значительно возросла перфузия инфарцированных областей. Авторы полагают, что имплантация стволовых клеток в сердце является безопасной и могла бы индуцировать развитие кровеносных сосудов, улучшая, таким образом, перфузию инфарктного миокарда.

Исследованием ученых Stanford University School of Medicine (Palo Alto, США, 2005) выявлено, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) не способны замещать сердечную мышцу после инфаркта, что опровергает более ранние предположения (Balsam et al., 2004). Они обнаружили, что у мышей ГСК присутствуют в поврежденных сердцах, но сохраняют при этом фенотип клеток крови и не трансформируются в мышечные клетки. Это исследование отличается от предшествующих работ, в которых исследователи использовали цельный костный мозг мышей и затем выделяли их него различные популяции клеток, включая высокоочищенную субпопуляцию стволовых клеток, клетки которой могут формировать все виды клеток крови. До этого в экспериментах использовали менее однородные по своему составу клетки. Однако это исследование не исключает важной роли стволовых клеток в восстановлении функции сердца. Трансплантированные кроветворные клетки могут вовлекать в работу новые кровеносные сосуды в поврежденных тканях. Эти новые сосуды могут сохранить жизнеспособность сердечных мышечных клеток, которые в противном случае погибли бы, и таким образом косвенно сохраняют миокард. Методами генной инженерии клетки можно дополнительно модифицировать, задействовав при этом новые кровеносные сосуды, так что они могут стать частью успешного лечения.

Исследование ТОРС ARE- AMI (The Transplantation of Progenitor Cells And Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction) позволит оценить у больных с острым инфарктом миокарда безопасность, выполнимость и потенциальное воздействие на функцию миокарда внутрикоронарного введения или циркулирующих в периферической крови прогениторных клеток эндотелия (СРС), или полученных из костного мозга (ВМС) прогениторных клеток (Schachinger et al., 2005). Результаты этого исследования показывают,

15





что у больных острым инфарктом миокарда, которым успешно была проведена реваскуляризация методом стентирования, внутрикоронарное введение прогениторных клеток эндотелия (СРС или ВМС) безопасно и выполнимо. Абсолютная безопасность метода и благоприятное влияние на ремодели-рование левого желудочка послужили основанием для более крупных рандомизированных двойных слепых испытаний. Длительные, двухлетние клинические испытания TOPCARE-AMI выявили, что показатели ЛБФВ сохранялись, и даже наблюдался ее прирост у пациентов с клеточной трансплантацией, и уровень в сыворотке крови NT-proBNP, как объективного показателя ремоделирования левого желудочка сердца, неуклонно снижался. Длительное наблюдение в клинических испытаниях необходимо для I мониторинга устойчивости функционального эффекта, наблюдаемой у пациентов, которым ввели ГСК после ОИМ.

Мобилизация периферических стволовых; клеток крови (PBSCs) грануло- I цитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF) и интракоронарное их ] введение были исследованы в качестве альтернативы инвазивному забору клеток костного мозга. В Южной Корее в рандомизированном испытании с участием пациентов с ОИМ, которые перенесли стентирование, применение I G-CSF в сочетании с интракоронарным введением PBSCs показало улучшение 1 функции сердца и усиление ангиогенеза (Kang et al„ 2004). Однако при этом I стало серьезной проблемой учащение рестенозов, и дальнейшее расширение исследования было приостановлено. Возможное объяснение этого небла- I гоприятного эффекта — дифференцировка мобилизованных G-CSF проге- I ниторных клеток в гладкомышечные клетки в местах стентирования. Авторы предостерегают, что при дальнейшем использовании терапии мобилизо- I ванными G-CSF стволовыми клетками пациенты должны тщательно обследоваться на предмет непредвиденных эффектов.

Одним из часто применяемых критериев оценки считаются изменения в показателях общей левой желудочковой фракции выброса (ЛБФВ) сердца до ] и после клеточной трансплантации, которая обычно является оценочным I критерием в клинических испытаниях.

В немецких исследованиях BOOST на 60 пациентах статистически значимый 1 позитивный эффект введения ГСК костного мозга был установлен по истечении шести месяцев. Показатель левой желудочковой фракции выброса (ЛБФВ) вырос на 6,7% в группе ГСК и только на 0,7% — в контрольной группе. Однако по истечении 18 месяцев разница в показателях между группами исчезла.

Два крупнейших на сегодняшний день клинических испытания были проведены группами немецких и норвежских ученых. Немецкое исследование REPAIR-AMI (2005) включало 204 пациента и показало, что в группе с введением гемопоэтических стволовых клеток показатель ЛБФВ составляет 5,5% по сравнению с 3% в контрольной группе. Разница являлась статистически значимой, но интерпретации результатов препятствовало использование вентрикулографии вместо более надежных методов оценки ЛБФВ у пациентов с инфарктом миокарда.

Норвежское исследование AST AMI (2005) включало 100 пациентов только ] с инфарктом передней стенки сердца и не обнаружило никаких значительных
различий в показателях между группами при изменении в ЛБФВ от исходного уровня в течение шестимесячного наблюдения, как было показано методами SPECT, эхокардиографии и MRI. Примечательно, что там было обнаружено похожее улучшение показателей ЛБФВ в обоих группах: 8,1% — в группе с введением ГСК костного мозга и 7,0% — в контрольной группе. Похожий прирост в ЛБФВ по прошествии шести месяцев (8,5% — в опытной группе и 8% — в контрольной группе) наблюдался и в датском клиническом исследо­вании STEMMI, сообщившем об отсутствии эффекта мобилизации ГСК из костного мозга при цитокиновой стимуляции в острой фазе инфаркта миокарда.

Можно полагать, что все эти клинические испытания подтвердили безопас­ность лечения ГСК костного мозга, а отличия между ними могут быть из-за различия в числе введенных клеток и самой технологии приготовления клеток, времени распределения и других неучтенных факторов. Тем не менее су­ществует, на мой взгляд, несколько фундаментальных общих ограничений в методологии.

Мы знаем, что только малые количества ГСК, вводимые интракоронарно, остаются в месте введения в сердце (~ 4%). В настоящее время концепция трансдифференцировки ГСК подвергается обоснованным сомнениям, и были предложены другие механизмы действия, такие, как паракринная регуляция и иммунная модуляция, которые все же нуждаются в доказательствах.

Однако до сих пор во всех клинических испытаниях не был достоверно и однозначно доказан долгосрочный эффект от лечения ГСК костного мозга пациентов с острым инфарктом миокарда. Все исследования показали, что если и имеется эффект от этого инвазивного лечения, то он, по-видимому, слабый.

Тем временем, пока некоторые исследователи требуют углубленных клинических испытаний для изучения эффекта нефракционированных популяций ГСК костного мозга с применяемой в настоящее время методологией, поиск популяции клеток с большей потенцией и методов подтверждения долговременного приживления большего количества клеток продолжается. Основанное на доступных данных, наше мнение заключается в том, что необходимо большее количество экспериментальных доказательств для определения более эффективных путей клеточной терапии пациентов.

Функциональная регенерация сердца, в прямом смысле, требует замены мертвых кардиомиоцитов. Некоторые стволовые и прогениторные клетки, полученные из костного мозга, циркулирующей крови или из ткани миокарда, приобрели кардиомиогенный фенотип после инъекции или инфузии в сердце. Однако противоречивые данные экспериментальных исследований несмогли Доказать дифференцировку костномозговых стволовых клеток в кардио-миоциты. Причина этого непонятна и может являться следствием технических вариаций экспериментальных условий. Более того, разные прогениторные клетки могут иметь различные возможности для дифференцировки в кардиомиоциты. Даже исследования, не доказывающие дифференцировку в

|кардиомиоциты, подтвердили повышенную восстановительную способность работы сердца после ввода клеток, подчеркивая важность дополнительных механизмов, посредством которых клеточная терапия может вызывать

положительные эффекты. Слияние клеток могло бы быть альтернативным механизмом, лежащим в основе приобретения сердечного фенотипа прогениторными клетками. Однако скорость процессов слияния клеток мала в большинстве проведенных исследований.

Дальнейшие эксперименты выявили новую форму связи между прогени­торными клетками и кардиомиоцитами, т. е. образование "нанотрубчатых магистралей", которые позволяют осуществлять перенос протеинов и органелл, таких, как митохондрии, между двумя разными типами клеток. Пере­нос митохондрии от мезенхимальных стволовых клеток к клеткам с не достат­ком митохондрии показал его необходимость для аэробного дыхания в клетках-приемниках. Несмотря на то что важность in vivo и in vitro фактов неустанов-лена, транспорт протеинов или органелл может повлиять на судьбу клетки и работу прогениторных клеток.

Полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки (МСК) способны дифференцироваться в кардиомиоциты in vitro. Трансплантиро­ванные в миокард МСК могут под влиянием микроокружения дифференциро­ваться и экспрессировать сердечный фенотип in vivo (Wang et al., 2000). Чтобы исследовать способность человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) дифференцироваться в мышечный фенотип и регенерировать i мышечную ткань при сердечной недостаточности, специалисты американской компании Osiris Therapeutics Inc., специализирующиеся на клеточных технологиях, создали определенные условия культивирования для индукции миогенной дифференцировки МСК, а также трансплантировали МСК в сердца экспериментальных животных.

При проведении операции на открытом сердце группа специалистов Osiris Therapeutics Inc. имплантировала человеческие МСК непосредственно в стенку желудочка бестимусных крыс. МСК были витально помечены и идентифици­рованы по специфическим антителам, которые реагируют только с антигенами человека (но не с тканями животного-реципиента). Было установлено, что МСК приживаются в сердце в различные сроки после трансплантации, и в них была отмечена экспрессия специфических мышечных белков. Результаты еще одного экспериментального исследования на свиньях, проведенного в Johns Hopkins University (Baltimore, USA), показали, что взрослые МСК (полученные по методике Osiris Therapeutics) могут с эффектом использоваться для лечения инфаркта миокарда. Аллогенные МСК костного мозга, трансплантированные в поврежденное сердце животного, способны восстанавливать функцию сердца до ее первоначального уровня. Клетки были введены непосредственно в миокард, используя специальный катетер (Biocardia Inc.), введенный в артерию путем ее пункции по типу процедур, выполняемых с целью катетеризации сердца. Методика эта безопасна и эффективна. Ее использование расширит области применения клеточной терапии стволовыми клетками в будущем; наиболее существенны исследования с использованием внутривенного пути введения.

Если дальнейшие экспериментальные исследования и клинические испытания окажутся одинаково успешными, то, по мнению исследователей, эта технология смогла бы стать новым распространенным методом лечения по

18

установлению и созданию условий для полной обратимости повреждения ердечной мышцы после инфаркта или другого поражения, вызванного крушением ее кровоснабжения. Использование МСК позволит также обежать потенциальных проблем с иммуносупрессией, при которой иммунная ;цстема каждого животного, возможно, реагировала на стволовые клетки, юлученные из других источников, кроме своих собственных.

Поскольку МСК остаются на ранних стадиях развития, то они не вызывают иммунного ответа, в отличие от более дифференцированных стволовых клеток. )дно из многих преимуществ этого метода состоит в том, что взрослые СК шляются легкодоступными, они могут быть получены от самого пациента, и к требуется донорство, при необходимости клетки могут быть размножены.

В 2001 г. в Клинике кардиохирургии Ростока (Clinic of Cardiac Surgery) во фемя операции шунтирования МСК костного мозга мужчины были грансплантированы путем микроинъекций непосредственно в ткань его собственного сердца. После процедуры не было обнаружено никаких зсложнений, и медики выполнили такую же процедуру на других пациентах.

В кардиохирургической клинике Санкт-Петербургского ЕМУ в период с люня 2003 г. по март 2005 г. стволовые клетки в виде аутологичных мононук-геаров костного мозга (АМКМ) применены у 56 больных, которые страдали шлемической болезнью сердца (ИБС) или дилатационной кардиомиопатией (ДКМП). Интрамиокардиальное введение АМКМ выполнено во время операции аортокоронарного шунтирования, или АМКМ вводились через катетер во время коронарографии как отдельная процедура на фоне стабильного лечения традиционными медикаментозными препаратами. Медикаментозная терапия, подобранная за месяц до начала клеточной терапии, не менялась в течение всего срока наблюдения (до 18 месяцев) ни по качеству, ни по количеству. Клинически улучшение самочувствия отметили все больные. Уменьшение сердечной недостаточности и (или) коронарной недостаточности на 1—2 ступени отмечено в течение первых 2—3—6 месяцев после инфузии АМКМ, что нашло подтверждение при контрольном проведении нагрузочного теста с 6-минутной ходьбой. При эхокардиографии в среднем глобальная фракция изгнания левого желудочка увеличилась на 12±6%. Отмечено уменьшение конечного диастолического и конечного систолического объемов левого желудочка. ОФЭКТ подтвердила отчетливое уменьшение зон гипоперфузии миокарда в сроки 3 и 6 месяцев. Данные за 12 месяцев незначительно отличаются от данных по состоянию перфузии миокарда за 6 месяцев. При позитронной эмиссионной томографии миокарда отмечено Улучшение перфузии и метаболизма миокарда через 3—6 месяцев после введения АМКМ.

Улучшение перфузии миокарда и метаболизма при интрамиокардиальном или интракоронарном введении АМКМ дает возможность использовать данный Метод лечения не только в целях коррекции сердечной недостаточности, но и Для лечения коронарной недостаточности у больных с дистальным поражением к°ронарного русла.

Следует подчеркнуть, что наибольший эффект достигнут в тех случаях, к°гда имел место рецидив стенокардии при сохранной работе по крайней мере

19

одного из ранее наложенных шунтов или при дистальной форме поражения коронарных артерий (Немков и др., 2005).

В НИИТиИО (Москва) у пациентов с сердечной недостаточностью после! лечения, включавшего медикаментозную терапию, реваскуляризацию ] миокарда и трансплантацию МСК костного мозга, изучали значение и динамику I биологически активных веществ, потенциально значимых в патогенезе! сердечной недостаточности, обратного ремоделирования миокарда и! неоангиогенеза: ИЛ-6, С-реактивного белка (СРВ, hs СРВ), неоптерина (НП), I церулоплазмина (ЦП), Fas-опосредованного апоптоза (растворимой формы 1 индуктора апоптоза — sFas-L и ингибитора апоптоза — sFas). Обследован 411 пациент: 39 мужчин и две женщины (37 — ишемическая болезнь сердца, 4 —1 дилатационная кардиомиопатия), 16 пациентам трансплантацию клеток! выполняли интракоронарно и/или интракардиально во время ангиопластики | или во время операции аортокоронарного шунтирования. Изменение! параметров функциональной регенерации миокарда через 1 и 6 месяцев после I ТАККМ связано с уровнями маркеров воспаления и апоптоза в плазме крови I пациентов до лечения. Позитивная динамика наблюдалась у всех больных с I нормальными исходными уровнями маркеров воспаления. У пациентов с J повышенными исходными уровнями С-реактивного белка и неоптерина I тенденция к позитивным изменениям функции миокарда левого желудочка ] обнаружена у тех больных, у которых происходило снижение уровней маркеров I воспаления в течение 1 и 6 месяцев после лечения (Шевченко и др., 2005).

В Германии, России, Франции, США и Китае уже проводятся трансплан-! тации клеток костного мозга [26,35,37,46], аутологичных миобластов [44,45,1 47] пациентам с ИБС и кардиомиопатиями. Большинство исследователей I отмечают безопасность применения аутологичного материала, его неаритмоген-1 ность; однако после ТП миобластов в некоторых случаях отмечались аритмии I [41], иногда с летальным исходом [42], поэтому использование этого вида клеток 1 для ТП в миокард нежелательно. Остановимся несколько подробнее на этом I вопросе.

Клетки, взятые из скелетных мышц и введенные в инфарцированные области I миокарда, встраиваются в миокард и приобретают некоторые свойства! кардиомиоцитов. Очень важно, что клеточные трансплантаты улучшают I сократимость в инфарктных областях. В смоделированный криозондом! инфарктный миокард кроликов были трансплантированы аутологичные I скелетные миобласты (предшественники мышечных клеток), чтобы! предотвратить рост зоны некроза после экспериментального инфаркта! миокарда (ИМ) (Taylor et al., 1998). Последующие гистологические I исследования сердца показали, что в области инфаркта имеются различные I по размерам островки удлиненных исчерченных клеток, проявляющих I характеристики и скелетных, и сердечных мышечных клеток. У кроликов после I трансплантации миобластов улучшилась функция сердца. Возможность I регенерации функционирующей мышцы после аутологичной трансплантации I миобластов может иметь важное значение для пациентов после ИМ.

После ИМ главный определяющий фактор неблагоприятного прогноза — I постинфарктное ремоделирование, сопровождающееся левожелудочковой

20

пилатацией. Имплантация скелетных миобластов улучшает функцию постинфарктного сердца путем регуляции процессов неблагоприятного ремоделирования, и это действие может быть значительно усилено Нацеливанием на интерлейкин-1 (IL-1), который является ключевым регулятором неблагоприятного ремоделирования и смерти транспланти­рованных клеток (Murtuza et al., 2004). В другом исследовании имплан­тированные скелетные миобласты формировали жизнеспособные трансплан­таты в инфарктном миокарде, в результате чего улучшали сократительную функцию постинфарктного сердца и уменьшали степень желудочковой дилатации (Jain et al., 2001). Эти данные показали, что трансплантация сингенных миобластов после ИМ улучшает измеренные in vivo и ex vivo показатели общей желудочковой дисфункции и патологического ремодели­рования, и свидетельствуют о том, что клеточная трансплантация может оказывать лечебный эффект после ИМ.

Аутологичные скелетные миобласты — первые клетки, которые стали использоваться в клинике у больных с выраженной сердечной недостаточ­ностью ишемического генеза, и они имеют свои преимущества. Предвари­тельные данные I фазы клинических испытаний подтвердили выполнимость и безопасность аутологичной трансплантации скелетных миобластов при тяжелых формах ишемической кардиомиопатии (Menasche, 2003). Есть некоторые данные об аритмогенном потенциале миобластов. Предварительные данные относительно эффективности обнадеживают, но они должны быть подтверждены крупными проспективными рандомизированными исследо­ваниями. В настоящее время в клинических испытаниях клеточной трансплантации для лечения ИБС участвуют более 150 пациентов во всем мире (главным образом в Европе).

Genzyme Biosurgery в сотрудничестве с Myosix SA of Paris проводит П фазу клинических испытаний, проверяющих безопасность и эффективность трансплантации миобластов в сердце с целью предотвращения прогресса сердечной недостаточности у больных, перенесших инфаркт миокарда. Исследование предполагает забор собственных (аутологичных) клеток скелетной мышцы пациента до операции шунтирования методом малоинва-зивной биопсии нижней конечности, размножение клеток в течение трех недель в лаборатории и введение их в поврежденную область сердца в бассейн шунта коронарной артерии. Первый пациент, давший согласие на участие в исследовании, был пролечен в декабре 2002 г. в Но pitaux de Paris. Ожидается, что в дальнейших клинических исследованиях примут участие пациенты не только из Франции, но и из других стран Европы, США и Канады. Однако интерпретация результатов клеточной трансплантации затруднена по Различным причинам: малочисленность наблюдений, неоднородность групп пациентов, комбинация клеточной терапии с медикаментозным и хирурги­ческим лечением.

MyoCell ™ (Биосердце) — препарат регенерационной тканевой терапии Для лечения целого спектра сердечно-сосудистых заболеваний, начиная от стенокардии до терминальных стадий болезней сердца. Аутологичные Миобласты выделяются из биоптата скелетной мышцы. Терапия MyoCell ™

21

состоит из патентованной среды транспорта и среды введения, процесса ферментной диссоциации биоптата, процесса селекции миобластов] питательной среды и последующей трансплантации в поврежденную сердечную] мышцу. Ферментативный процесс диссоциации позволяет получить весьма] специфическую субпопуляцию миобластов, а среда для введения сохраняет] клетки в неизменном виде в течение восьми дней до момента введения и позволяет мышце расти постепенно, а не бесконтрольно и способствует] лучшему формированию мышцы. В состав Биосердца MyoCell ™ гарантиро-] ванно входит активный ингредиент, состоящий из клеточной популяции] способной приживаться, пролиферировать, адаптироваться к сердечному] микроокружению и поддерживать работу сердца. Миобласты доставляются] транскутанно по катетеру по той же системе, какая используется во время операции коронарного шунтирования.

В 2001 г. была проведена первая чрезкожная малоинвазивная трансплан J тация в поврежденные области постинфарктного сердца культивированных] аутологичных миобластов, взятых путем биопсии скелетной мышцы бедра] пациента (Bioheart Inc's MyoCell). Процедура была выполнена группой кардиохирургов в медицинском центре Роттердамского университета в] Нидерландах. В поврежденные участки миокарда пациента было сделано десять] инъекций общим числом 25 млн. клеток с использованием внутрижелудочко-! вого зонда, введенного в бедренную артерию. Пациент был выписан через 24 ч] и три дня спустя чувствовал себя удовлетворительно. Это исследование было] частью оценки безопасности препарата Биосердца MyoCell, который теперь] находится на III фазе клинических испытаний в Европе. Это может стать одним] из самых значительных исследований в истории лечения пациентов с] заболеваниями сердца.

Для целей клеточной кардиомиопластики используется прямое введение в| постинфарктный рубец клеток с регенерационным потенциалом. Эта] процедура может быть проведена с использованием MyoCath ™ — частью! Биосердца, представляющей собой зондовую систему доставки препарата] MyoCell ™ в миокард посредством ретроградной катетеризации полости левого] желудочка. Поскольку было отмечено, что имплантация аутологичных] скелетных миобластов приводит к замещению ^функционирующего] миокардиального рубца функционирующей мышцей и восстановлению! функции миокарда, имплантация миобластов во время операции шунтирования! коронарных артерий или трансэндокардиально может привести к тем же самым! результатам. В принципе, имплантация миобластов по катетеру может! обеспечить тот же самый терапевтический эффект. В рамках программы! MYOHEART (Myogenesis Heart Efficiency and Regeneration Trial) проводится! мультицентровое открытое нерандомизированное клиническое исследование,! которое призвано оценить безопасность и кардио- и ангиопротективный эф-] фекты MyoCell™, имплантированного с использованием системы MyoCath™] при застойной сердечной недостаточности после инфаркта миокарда в] сочетании с установленным дефибриллятором-кардиовертером.

Перечень проводимых клинических испытаний клеточной терапии при] сердечно-сосудистых заболеваниях представлен в таблице (сайт ЦБМТ).

22

Клинические испытания клеточной терапии в лечении сердечно-сосудистых заболеваний

Показание Тип клеток и характер Тип Спонсор

воздействия исследования

ОИМ Интракоронарное введение Открытое иссле- Goethe-University

взрослых прогениторных кле- дование (Frankfurt, Germany)

ток (TOPCARE-AMI)

ЗСН после Трансплантация аутологичных II фаза GenVec

ИМ миобластов

ЗСН с необ- Введение 25—45 млн. аутоло- Открытое иссле- University of Pitts-
ходимостью гичных стволовых клеток, выде- дование на 5—10 burgh, Pennsylvania
установки ленных из костного мозга, в пациентах
левожелу- пораженный миокард во время
дочкового операции установки левоже-
обхода лудочкового обхода

"ИБС, ИМ, MYOHEART (Myogenesis Heart I фаза Bioheart Inc.
ЗСН Efficiency and Regeneration
Trial). Препарат: MyoCell™.
Устройство: MyoCath

ИМ Ex vivo размножение аутоло- II фаза Genzyme Biosurgery /

гичных мышечных клеток и Myosix SA (Paris)

имплантация в рубцовую зону сердца во время операции шун-

тирования коронарных артерий

ИМ Интракоронарное введение ауто- Открытое иссле- Heinrich-Heine-Uni-

логичных мононуклеарных кле- дование на 10 па- versity (Dusseldorf,

ток костного мозга циентах Germany)

ИМ Введение аутологичных клеток Открытое иссле- University of Rostock

костного мозга в пограничную дование на 6 па- (Rostock, Germany)

зону инфаркта пациентов, пере- циентах
несших шунтирование

ИМ Внутривенное введение взрос- I фаза Johns Hopkins/ Osiris

лых МСК, выделенных из кост- Therapeutics

ного мозга пациента

ИМ и ЗСН Препарат MyoCell, состоящий III фаза в Европе Bioheart Inc./ Univer-
из запатентованных транспорт- sity of Rotterdam, The

ной среды, среды введения, Netherlands

ферментативной диссоциации биоптата, процесса выделения миобластов, среды культиви­рования и трансплантации в

пораженную мышцу сердца

ИБС с сер- Аутологичные скелетные мио- Открытое иссле- Bichat-Claude-Bernard
Дечной не- бласты дование Hospital Paris (France)

Достаточ­ностью

23

Клеточная терапия болезней сердца еще не доказала своей бесспорной эффективности. Только десять клинических испытаний по применению клеток костного мозга для лечения болезней сердца были закончены с положительным результатом. Процент полного восстановления сердечной функции у пациен­тов был низок. Трудности в применении клеток костного мозга для лечения болезней сердца действительно означают недостаточный уровень исследован-ности стволовых клеток и говорят о необходимости проведения новых исследований.

Один из новых методов лечения болезней сердца, в котором используются стволовые клетки, разрабатывается в Йоркшире в Sheffield University. В случае успеха он позволит получить значительно лучшие результаты лечения и даст многим пациентам более долгую жизнь. Ученые этого университета создали первое в мире регенеративное устройство на основе стволовых клеток для вставки в поврежденные болезнью артерии. Ученые считают, что в случае успеха испытаний их изобретение сможет спасти тысячи жизней.

Каждый год во всем мире от заболеваний коронарных артерий умирает около 7 млн. человек. Один из самых распространенных в настоящее время способов лечения—имплантация стента (эндопротеза сосуда). Это устройство расширяет сузившийся в результате болезни просвет артерии и позволяет крови лучше проходить через нее.

Чтобы стент не вызывал иммунной реакции, его покрывают специальными '■ веществами, но это не самое лучшее решение. Ученые из Sheffield University считают, что гораздо лучшие результаты даст покрытие стента из человеческих стволовых клеток. Это позволит не только избежать реакции отторжения, но и добиться более полной интеграции имплантата и стимуляции процессов регенерации. В данном исследовании используются эмбриональные стволовые клетки, которые выделены и культивируются в лабораториях университета.

В настоящее время проводятся исследования на животных, но как только I будет установлена безопасность и эффективность нового метода, будут начаты его клинические испытания.

Методики с применением стволовых клеток костного мозга являются достаточнб безопасными, потому что пациентам вводятся их собственные клетки. Исследователи из Медицинской школы Питтсбургского университета США (University of Pittsburgh School of Medicine — UPMC) сегодня продолжают набор добровольцев для участия в клинических испытаниях клеточной терапии стенокардии. Цель этого общенационального исследова­ния — установить безопасность и эффективность лечения аутологичными стволовыми клетками (СК) пациентов, которым по каким-либо причинам не подходят традиционные методы терапии. Предполагается, что введение стволовых клеток будет стимулировать ангиогенез — рост кровеносных сосудов — в той части сердца, которая из-за сужения коронарных артерий страдает от недостатка кровоснабжения. К настоящему времени в UPMC Car­diovascular Institute уже есть шесть пациентов, готовых к участию в испытаниях, и будет набрано еще 20 добровольцев. Всего же в 15—20 медицинских центрах США, проводящих это исследование, новый метод будет использован в лечении 150 человек в течение 2007—2008 гг. Эти клинические испытания спонсируются

24

0дразделением клеточной терапии известной американской компании Baxter Healthcare Corp. Экспериментальный метод лечения предназначен для больных стенокардией, страдающих от болей в груди и одышки, несмотря на проведенное традиционными методами лечение.

Участники испытаний в течение пяти дней будут принимать препарат, сти-]угулирующий выход стволовых клеток в кровь, после чего при помощи спе­циального оборудования СК будут выделены из крови. Затем СК будут введены в определенную область сердца. После этой процедуры будет выполнен долго­временный мониторинг состояния пациентов с учетом проявления симптомов болезни, суточной активности, тестов на нагрузку, показаний МРТ и т.д.

Для участия в испытаниях приглашаются взрослые добровольцы с тяжелой болезнью коронарных артерий, которым не предлагаются проведение ангиоплас­тики, операции игунтирования и лечение другими традиционными методами.

По утверждениям клиницистов, методика аутологичной трансплантации клеток костного мозга безопасна, поскольку после лечения приблизительно 250 пациентов во всем мире неблагоприятного эффекта не наблюдалось, и результаты пока являются обнадеживающими. Большинство исследований, однако, свидетельствуют о 5—10%-ном улучшении функции сердца. Возможно, это немного, но, имея в виду тот факт, что большинство пациентов были очень больны к началу лечения, — это значительный результат.

Таким образом, в настоящее время метод клеточной трансплантации рассматривается большинством исследователей как перспективный. Метод уже применяется в клинической практике для улучшения прогноза у больных с сердечной недостаточностью (СН) различного генеза (ИБС, дилатационная и ишемическая кардиомиопатии и др.). Результаты трансплантации аутоло-гичных взрослых СК КМ у больных ИБС, облитерирующими заболеваниями периферических сосудов за рубежом и в России говорят об улучшении результатов традиционных методов лечения и, что немаловажно, о безопасности применения аутологичных СК КМ в клинике: ни в одном из опубликованных клинических исследований не было указаний на развитие каких-либо осложнений, связанных с использованием СК КМ.

Вместе с тем нельзя не отметить, что к настоящему моменту данных, позволяющих рекомендовать методы клеточной терапии для широкого внедрения в повседневную клиническую практику, недостаточно. Необходимы хорошо продуманные и качественно выполненные клинические исследования, Целью которых было бы определение эффективности различных вариантов клеточной терапии при заболеваниях сердца, разработка показаний и противопоказаний к использованию данного метода, выработка рекомендаций по комбинированию методов клеточной терапии с традиционными хирурги­ческими и консервативными подходами к лечению болезней сердца.

Литература

1 • Галанкин В.Н. Некоторые вопросы регенерации и гипертрофии миокарда. Автореф. дис. ... д.м.н. М., 1974. 24 с.

2- Kim W.H., Joo С. U., Ku J.H. et al. Cell cycle regulators during human atrial develop­ment // Korean J. Intern. Med., 1998. Vol. 13. P. 77-82.

25

  1. СаркисовД. С. Регенерация и ее клиническое значение. М.: Медицина, 1979.284 с.

  2. ПалежаевЛ.В., АхабадзеЛ.В., МузлаеваНА., ЯвичМ.П. Стимуляция регенерации мышцы сердца. М.: Наука, 1965. 396 с.

  3. Hierlihya A.M., Sealea P., Lobeb С.G. et al. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population // FEBS Letters., 2002. Vol. 530. P. 239—243.

  4. BeltramiA.P., BarlucchiL., TorellaD. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell., 2003. Vol. 114. P. 763—776.

  5. Ohab H, Bradfutecd S.B., Gallardoe T.D. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation and fusion after infarction // PNAS, 2003. Vol. 100(21). P. 12313-12318.

  6. Kajstura J., Torella D., Urbanek K. et al. Senescence and death of primitive cells and myocytes leads to premature cardiac aging and heart failure // Circ. Res., 2003. Vol. 93. P. 604-613.

  7. Messina E., Angelis L.D., Frati G. et al. Isolation and Expansion of Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart // Circ. Res., 2004. Vol. 95. P. 911—921.

  8. Koh G. Y., SoonpaaM.H., KlugM.G. et al. Stable fetal cardiomyocyte grafts in the hearts of dystrophic mice and dogs. // J.Clin. Invest., 1995. Vol. 96. P. 2034—2042.

  9. LeorJ., Patterson M., Qumones MJ. et al. Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the Infarcted Myocardium of Rat A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium? // Circulation, 1996. Vol. 94[suppl II]. P. II, 332-336.

  10. Li R.K., Jia Z.Q., Weisel R.D. et al. Cardiomyocyte transplantation improves heart function. // Ann. Thorac. Surg., 1996. Vol. 62. P. 654—660.

  11. Chiu R.C., Zibaitis A., Kao R.L. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration with satellite cell implantation // Ann. Thorac. Surg., 1995. Vol. 60. P. 12—18.

  12. Murry C.E., Wiseman R. W., Schwartz S. M. et al. Skeletal Myoblast Transplantation for Repair of Myocardial Necrosis. // J. Clin. Invest., 1996. Vol. 98. P. 2512-2523.

  13. Atkins B.Z., Lewis C.W., Kraus W.E. et al. Intracardiac Transplantation of Skeletal Myoblasts Yields Two Populations of Striated Cells In Situ // Ann. Thorac. Surg., 1999. Vol. 67. P. 124-129.

  14. TomitaS., LiR.K., Weisel R.D. et al. Autologous transplantation of bone marrow cell inproves damaged heart function // Circulation, 1999. Vol. 100(suppl. II). P. II, 247— 256.




  1. LiR.K., Jia Z.Q., Weisel R.D. et al. Smooth Muscle Cell Transplantation into Myocar­dial Scar Tissue Improves Heart Function // J. Mol. Cell. Cardiol., 1999. Vol. 31. P. 513-522.

  2. Murry C.E., Kay MA,, Bartosek T. et al. Muscle Differentiation during Repair of Myo­cardial Necrosis in Rats via Gene Transfer with MyoD. // J.Clin. Invest., 1996. Vol. 98. P. 2209-2217.

  3. Потапов KB. Трансплантация фетальных кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард. Дис. ... к.м.н. М., 2003. 114 с.

  4. YooKJ., LiR.K., Weisel R.D. et al. Autologous Smooth Muscle Cell Transplantation Improved Heart Function in Dilated Cardiomyopathy // Ann. Thorac. Surg., 2000. Vol. 70. P. 859-865.

  5. РепинВ.С, СухихГ.Т. Медицинская клеточная биология. М.: РАМН, 1998. 200 с.

  6. Sakai Т., LiR.K, Weisel R.D. Autologous Heart Cell Transplantation Improves Car­diac Function After Myocardial Injury // Ann. Thorac. Surg., 1999. Vol. 68. P. 2074— 2081.

26

?3 Chiu R.C., Zibaitis A., Kao R.L. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration

' with satellite cell implantation // Ann. Thorac. Surg., 1995. Vol. 60. P. 12-18. 74. Wang JS., Shum-Tim D., Galipeau J. et al. Marrow stromal cells for cellular

cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages // J. Thorac. Cardiovasc.

Surg., 2000. Vol. 120. P. 999-1006.

  1. OrlicD., Kajstura J., ChimentiS.,AnversaP. et al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium // Nature. 2001. Vol. 410. P. 701-705.

  2. StrauerB.E., BrehmM., Zeus Т., KosteringM. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans.// Circulation. 2002. Vol. 106. N15. P. 1913-1918.

  3. Deb A., WangS., SkeldingKA. et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart// Circulation, 2003. Vol. 107. P. 1247—1251.

  4. Yeh Т.Н., Zhang S., Wu H.D. et al. Transdifferentiation of human peripheral blood CD34- enriched cell population into cardiomyocytes, endothelial cells and smooth muscle cells in vivo // Circulation, 2003. Vol. 108. P. 2070—2073.

  5. Nygren J.M., Jovinge S., Breitbach M., Sawen P. et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation// Nat. Med., 2004. Vol. 10. N5. P. 494—501.

  6. Balsam L.B. et al. Heamatopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischemic myocardium // Nature, 2004. Vol. 428. P. 668—673.

  7. Saito Т., Dennis J.E., Lennon D.P. et al. Myogenic expression of mesenchymal stem cells within myotubes of mdx mice in vitro and in vivo // Tissue Eng., 1995. Vol. 1. P. 327-343.

  8. Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Потапов И.В. и др. Выявление кардиоспеци-фического тропонина I в предифференцированных мезенхимальных стволовых клетках костного мозга млекопитающих // Вестник трансплантологии и ис­кусственных органов, 2002. № 3. С. 87.

  9. НатапоК., NishidaM., HirataK. et al. Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease Clinical Trial and Preliminary Results // Jpn. Circ. J., 2001. Vol. 65. P. 845—847.

  10. Kamihata H, Matsubara H., Nishiue T. et al. Implantation of bone marrow mononu­clear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional func­tion via side supply of angioblasts, angiogenic ligands and cytokines // Circulation, 2001. Vol. 104. P. 1046-1052.

  11. Stamm C, Westphal В., KliineH. et al. Autologous bone-marrow transplantation for myocardial regeneration // Lancet, 2003. Vol. 361. P. 45—46.

  12. TseH.F., Kwong Y.L., ChanJ.K.F. et al. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation // Lancet, 2003. Vol. 361. N9351. P. 47—49.

  13. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Гуреев СВ., Онищенко НА., Темное А А. и др. Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга для восстановления функции поврежденного миокарда // Материалы I Межд. конф. "Альтернативные методы реваскуляризации миокарда". М., 2004.

  14. ChavakisE., DimmelerS. Regulation of endothelial cell survival and apoptosis during angiogenesis // Arterioscl., Thromb. and Vase. Biol., 2002. Vol. 22. P. 887—892.

  15. DimmelerS., ZeiherA.M. Wanted! The best cell for cardiac regeneration // J. Am. Coll. Cardiol, 2004. Vol. 21. N 44(2). P. 464-466.

  16. Kinnaird Т., Stabile E., Burnett M.S., Lee C.W., BarrS. et al. Marrow-derived stromal

27

cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms // Circ. Res., 2004 Vol. 94. P. 678-682.

  1. SmitsP.C, van GeunsR.J., PoldermansD. et al. Catheter-based intramyocardial injec­tion of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up // J. Am. Coll. Cardiol., 2003. Vol. 42 P. 2063-2069.

  2. БокершЛА., Ло П.К., Беришвили И.И., Голухова Е.З. и др. Первый клинический опыт применения аллогенных скелетных миобластов для лечения пациентов с ишемической кардиомиопатией // Бюллетень НЦССХ им. А. В. Бакулева РАМН 2004. Т. 5. № 4. С. 142-151.

  3. Assmus В., Schachinger V., Теире С. et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction // Circulation, 2002. Vol. 106. P. 3009-3017.

  4. HagegeAA., Carrion C, MenascheP. et al. Viability and differentiation of autologous skeletal myoblast grafts in ischaemic cardiomyopathy // Lancet, 2003. Vol. 361. P. 491— 492.

  5. MenascheP., HagegeAA., Vilquin J.T. et al. Autologous skeletal myoblast transplan­tation for severe postinfarction left ventricular dysfunction // J. Am. Coll. Cardiol., 2003. Vol. 41. P. 1078-1083.

  6. Schachinger V., Assmus В., Britten M.B. et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction Final One-Year Results of the TOPCARE-AMI Trial // J. Am. Coll. Cardiol., 2004. Vol. 44. P. 1690-1699.

  7. PaganiF.D., DerSimonian H, ZawadzkaA. et al. Autologous skeletal myoblasts trans­planted to ischemia-damaged myocardium in humans. Histological analysis of cell survival and differentiation // J. Am. Coll. Cardiol., 2003. Vol. 41. P. 879—888.

  8. Kawamoto A., Gwon H.C., IwaguroH. et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia // Circulation, 2001. Vol. 103. P. 634-637.

  9. KocherAA., Schuster M.D., SzabolcsMJ. et al. Neovascularization of ischemic myo­cardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function // Nat. Med., 2001. Vol. 7. P. 430-436.

  10. QuiriciN., SoligoD., CanevaL. et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133+ cells // British Journal of Haematology, 2001. Vol. 115. P. 186-194.

28

H. H. Беляев (Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина,

ЦБИ МОИ РК)

ЭНДОГЕННЫЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КАК ИСТОЧНИК АУТОЛОГИЧНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

Основные свойства гемопоэтических стволовых клеток.

Важнейшим источником стволовых клеток во взрослом организме, как теперь хорошо известно, является костный мозг. Все многообразие типов клеток крови, непрерывно поддерживаемое на протяжении человеческой жизни, создается благодаря пролиферативной активности этих клеток, называемых гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК). ГСК обладают двумя важнейшими характеристиками. Они воспроизводят дополнительное количество стволовых клеток через самообновление, а также подвергаются дифференцировке с образованием прогениторных клеток (предшественников), которые становятся коммитированными, т. е. "обязанными" дифференциро­ваться в клетки различных гемопоэтических линий. Последнее свойство составляет основу идеологии трансплантации костного мозга [1].

ГСК могут обладать четырьмя основными свойствами: самообновлением, мультипотентностью, способностью к длительной реконституции и вторичной трансплантабельностью [2].

При делении ГСК по крайней мере одна дочерняя клетка сохраняет состояние этой ГСК. Эта способность называется самообновлением. Причем при различных условиях микроокружения могут проистекать три различных процесса: симметричное деление, асимметричное деление или полная дифференцировка обеих дочерних клеток [3]. Симметричное деление увеличивает количество ГСК, тогда как при асимметричном делении ГСК-потенциал сохраняется только в одной дочерней клетке, а другая дифференци­руется в предшественники. Деление, которое генерирует две дифференциро­ванные прогениторные клетки, элиминирует ГСК-потенциал.

Существуют две противоположные точки зрения на способность к самообновлению у ГСК по мере старения организма. По одной из них в клеточный цикл и дифференцировку входят только покоящиеся ГСК, что приводит к безвозвратному уменьшению их потенциала с возрастом [4]. Однако показано, что 10% от общего пула ГСК костного мозга делится симметрично каждый день, за счет чего происходит поддержание репопуляционного потенциала ГСК [5]. Кроме того, трансплантация костного мозга от старых Доноров молодым или старым реципиентам показывает, что ГСК-потенциал остается интактным на протяжении всей жизни у мышей [6].

Мультипотентность заключается в способности ГСК дифференцироваться по различным направлениям. Эти направления включают образование эритро­цитов, мегакариоцитов и тромбоцитов, гранулоцитов, моноцитов и макрофа­гов, остеокластов и дендритных клеток, NK-клеток, тимоцитов, Т-клеток и

29

В-клеток. Стволовые клетки, обладающие способностью к самообновлению ■ но более ограниченные в способности к дифференциации, обычно называются прогениторами (предшественниками), например общие лимфоидные предшественники В-, Т-лимфоцитов, NK-клеток и лимфоидных дендритных клеток; общие миелоидные предшественники гранулоцитов, моноцитов макрофагов, остеокластов и миелоидных дендритных клеток; мегакариоцитар-ные и эритроцитарные предшественники; гранулоцитарно-макрофагальные предшественники. Однако даже более дифференцированные стадии этих I различных линий могут иметь свойства стволовых клеток, т. е. обладать способностью к самообновлению.

Под реконституцией понимают способность ГСК восстанавливать кроветворение в костном мозге после трансплантации иммунологически I совместимому реципиенту. В основе этого явления лежит хоуминг, т. е. 3 направленная миграция ГСК в свою тканевую нишу, которой во взрослом ] огранизме является костный мозг. В зависимости от степени зрелости ГСК реконституция может быть кратковременной и долговременной [2]. При ' кратковременной реконституции трансплантированные предшественники после заселения костного мозга вступают в цикл деления, при котором наступает полная дифференцировка обеих дочерних клеток. При этом происходит потеря ГСК-потенциала. Долговременная реконституция известна только для так называемых покоящихся ГСК, которые заселяют костный мозг и длительно генерируют клеточные линии различных направлений гемопоэза.

Способность ГСК к хоумингу является важнейшей предпосылкой успешной реконституции при трансплантации костного мозга. Самым изученным фактором хоуминга для ГСК является белок SDF-1 (stroma-derived factor-1). 3 Он вырабатывается стромальными клетками костного мозга и удерживает ГСК в своей стволовой нише за счет экспрессии на их поверхности рецептора для хемокинов CXCR-4. Имея такой рецептор, ГСК мигрируют в сторону большей концентрации SDF-1 [7]. Другой молекулой, обеспечивающей адгезию ГСК на стромальных клетках костного мозга, является pi-integrin [8].

Фенотипические маркеры ГСК.

Успешное исследование ГСК было бы невозможным без открытия специ-фических маркеров на поверхности этих клеток. Так, мышиные ГСК были идентифицированы как клетки, лишенные маркеров линейной принадлежности (Lin) и несущие маркеры Sea-1 (Ly-6A/E)+ и c-Kit (CD 117)+ [9]. Однако экс- 1 прессия Sea-1 на ГСК значительно варьирует у различных линий мышей [ 10]. В качестве альтернативного маркера предлагают использовать маркер CD34, хотя встречаемость этого маркера также варьирует от линии к линии [11]. Идентификация и очистка человеческих ГСК показали, что большинство их принадлежит к С034+-фракции. Эти клетки обнаруживаются в костном мозге, пуповинной и периферической крови [12,13]. Однако ГСК и незрелые мульти-потентные предшественники составляют только небольшую фракцию всего пула С034+-клеток, выделенных из гемопоэтической ткани. Большая часть примитивных гемопоэтических клеток, представленных в человеческом кост­ном мозге, обнаруживается в небольшой части (1—5 %) С034+-фракции, кото-рая почти не экспрессирует CD38 [14]. Эти клетки также не экспрессируют

30

, fjLA-DR и CD45RA, но ко-экспрессируют CD90 (Thy-1), CD 117 или СР Л [15—18]. Хотя использование CD34 в качестве маркера стволовых клеток

тного мозга широко применяется, имеются доказательства существования К°С ь примитивной популяции CD34 стволовых клеток. Эти клетки могут °46 пировать С034+-фенотип in vivo в SCID-мышах и даже обладают способ-1-6 тью дифференцироваться в клетки негемопоэтического ряда [ 19]. Дальней-Н е исследования уточнили фенотип данной популяции ГСК (CD 133+CD34~) показали их больший, чем у CD34+ ГСК, реконституционный потенциал [20]. Ияентифицированы и другие важные маркеры человеческих и мышиных ГСК с долговременным реконституционным потенциалом. Они включают VERFR-2, PSGL-1, CD45, CD 164, CXCR4, MDR, AA4, Bcrpl, ABCG2, endoglin и др. [21].

Наиболее часто для идентификации ГСК и ранних предшественников используют маркеры, приведенные в табл. 1 [22].

Как видно из таблицы, спектр CD-маркеров, присущих ГСК, довольно большой. Среди них абсолютной уникальностью обладают CD133 и CD164. Остальные маркеры в той или иной степени присутствуют и на некоторых типах зрелых клеток крови. Однако в настоящее время для выделения ГСК чаще всего используют моноклональные антитела к С034-маркеру.

Использование ГСК в гематологии. Трансплантационные проблемы.

Начиная с 1963 г. основным источником аллогенных гемопоэтических трансплантаций рассматривался костный мозг [23]. Аллогенная гемопоэти-ческая клеточная трансплантация успешно используется в качестве замести­тельной терапии пациентов с пластической анемией, лейкемией и некоторыми генетическими заболеваниями крови, а также активно исследуется как средство для лечения злокачественных и незлокачественных опухолей [24,25].

Таблица 1 CD-маркеры ГСК и ранних гемопоэтических предшественников

CD-маркеры Мультипотентные Зрелые клетки

ГСК/ранние предшественники

bdJj_____ Лимфоидные Т-клетки, тимоциты

_^lЈf__^^ Миелоидные Моноциты/макрофаги

4 ГСК/миелоидные

—— . и лимфоидные Эндотелиоциты

гЦ Лимфоидные Активированные В-клетки, плазмоциты

-S^iZiPgUenTop к SCF) ГСК Тимоциты

« (рецептор к IL-3) ГСК Моноциты/макрофаги, мегакариоциты,

—______ гранулоциты

• (Рецептор к IL-7) Лимфоидные Т-клетки, пре-В-клетки, моноциты

ЈР*131 (общая цепь

-^°Р?К IL-3 и IL-5) ГСК Моноциты/макрофаги

CD133

7^^____ гск -

CD 135

Т^г—-—__^ ГСК В-клетки, моноциты/макрофаги

^----^___^ ГСК -

31




I антитела к СБ34-маркеру прикрепляют тем или иным способом к железосодер-I жашим микрошарикам, покрытым поливинилпиролидоном или декстраном, I получая, тем самым, иммуноаффинный сорбент (рис. 1).

Суспензию клеток, содержащих ГСК, смешивают с микрошариками, а I затем переносят в специальную колонку или пробирку, помещенную в I постоянное магнитное поле. При этом клетки, несущие СБ34-маркер, фиксируются в матриксе колонки или на стенках пробирки, а все остальные клетки удаляются вымыванием или декантацией. Затем магнитное поле убирают и целевые клетки собирают для дальнейшего использования. По данным проточной цитофлуориметрии, чистота полученных ГСК превышает 90%.

Прямое выделение С034+-клеток представляет собой позитивную клеточную селекцию, в результате которой Т-клетки удаляются пассивно. Комбинирование активного удаления Т-клеток (через СБЗ-маркер) с последующей положительной селекцией CD34+- или CD 133+- клеток позволяет поднять уровень извлечения ГСК из костного мозга или периферической крови до 60%, а содержание Т-клеток понизить более чем в 30 раз. Аутологичная трансплантация ГСК.

Осложнения, связанные с гистосовместимостью, отсутствуют при проведе­нии аутологичной трансплантации костного мозга, например в случае забора костного мозга до миелоаблации у больных множественной миеломой [30]. Однако здесь возникает другая проблема, связанная с трудностями полного удаления злокачественных лимфоидных клеток из препарата, подготов­ленного для трансплантации, ввиду возможности повторного заноса опухоле­вых клеток [31].

Экспериментальные и клинические исследования показали высокую

I эффективность использования высокоочищенных и концентрированных препаратов аутологичных ГСК, выделенных из собственного костного мозга, при лечении аутоиммунных заболеваний [32—36].

((( /ЈХ ^\\

N ( Q<- f гск Ъе> >Q \ s

% ^ )))

С034-маркер

-<: ~<1 Моноклональное антитело к CD34 fc Железосодержащие микрошарики

Рис. 1. Схема иммуномагнитной сепарации ГСК

33

Однако, несмотря на значительные успехи в этой области, существует ряд серьезных проблем, которые в настоящее время невозможно решить окончательно. Среди причин, вызывающих высокую смертность и тяжелую инфекционную патологию, после трансплантации на первое место выходят вирусные и грибковые инфекции, а также реакция "трансплантат против хозяина" (РТПХ). Последняя связана с техническими проблемами получения "чистой" популяции ГСК из-за относительной малочисленности ГСК (0,01% от всех клеток костного мозга) в пунктате костного мозга.

Особое значение приобретает "загрязненность" препарата ГСК Т-лимфо-цитами. Именно совокупность этих клеток является основной контроли­рующей системой иммунологического надзора за антигенным постоянством клеток организма. На поверхности практически любых клеток организма экспрессированы так называемые антигены гистосовместимости, которые распознаются собственными Т-клетками как "свои" и потому игнорируются ими [26]. Вследствие этого чужеродные клетки, различающиеся по антигенам! гистосовместимости (HLA-система), введенные в организм реципиента, будут, безусловно, уничтожаться иммунной системой хозяина при активном участии | Т-клеток.

Как правило, для проведения трансплантации костного мозга тщательно подбирают донора по совместимости HLA-антигенов с реципиентом и, кроме I того, проводят миелоаблативную или иммуносупрессорную терапию,! заключающуюся в уничтожении клеток костного мозга химиопрепаратами или иммунодепрессантами [27]. Однако в этом случае часто происходит 1 инверсия направленности иммунологического конфликта: Т-клетки донора, | "загрязняющие" препарат стволовых клеток костного мозга, проявляют■ агрессию против клеток реципиента, что приводит к тяжелой патологии в j виде РТПХ, заканчивающейся в большинстве случаев летально. РТПХ1 представляет собой серьезное препятствие для клеточной терапии миело- и I лимфопролиферативных заболеваний препаратами аллогенного костного мозга ] [28]. Несомненно, что наилучшим способом борьбы с РТПХ является удаление I из донорского костного мозга всех зрелых Т-клеток. Методы очистки ГСК.

Именно с разработкой методов получения препаративных количеств чистых ГСК связывают большие надежды в области эффективной транспланта- 1 ционной клеточной терапии. Клинические испытания трансплантации ГСК, I лишенных Т-клеток, включали разнообразные методы клеточных манипуля- I ций ex vivo на протяжении последних 20 лет [29]. В ранних испытаниях I применяли такие методы, как Е-розеткообразование (розетки Т-клеток с I эритроцитами барана), агглютинация Т-лимфоцитов с SBA (агглютинин сои) 1 и противоточная элютриация. Однако два первых метода оказались I неприемлемы из-за использования растительного белка (SBA) и бараньих I эритроцитов, а третий метод оказался технически малопригодным (большие потери CD34+-KneTOK, неполное удаление Т-лимфоцитов, трудности со J стерилизацией оборудования, довольно длительная процедура выделения).

Новые методы были разработаны на основе иммуномагнитной сепарации 1 клеток. Сущность этих методов заключается в том, что моноклональные 1


1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


Учебный материал
© bib.convdocs.org
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации