Алиев. Современные клеточные технологии в медицине - файл n1.doc

Алиев. Современные клеточные технологии в медицине
скачать (1468 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc1468kb.21.10.2012 09:57скачать

n1.doc

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

32

Появдение коммерческих технологий иммуномагнитной сепарации CD34+-kji6,

ток позволило начать клинические испытания использования очищенных ГСк

при аутологичных и аллогенных трансплантациях. Особенно впечатляющ^

результаты получены при использовании ГСК у больных аутоиммунны^

заболеваниями, такими, как множественный склероз, системный склероз

ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, системная красная

волчанка, дерматомиозиты и тромбоцитопеническая пурпура [37]. Анализ

данных по лечению 390 больных, проведенному в Европе, Азии, Северной

Америке и Австралии, показал, что значительное клиническое улучшение

наблюдалось у двух третей пациентов по всем категориям болезней с большей

тенденцией к улучшению при ревматоидном артрите и ювенильноад

идиопатическом артрите. Однако лечение было ассоциировано со значительной

посттрансплантационной заболеваемостью, а также смертностью, частички

связанной с процедурой мобилизации ГСК из костного мозга (1,5%), и общей

процедурой трансплантации (9%) [38].

Несомненно, трансплантация ГСК при аутоиммунных заболеваниях возродила новые надежды и перспективы, но также подняла ряд вопросов, на которые пока нет ответа [39]. Перевешивает ли польза от появлении аутотолерантности и снижения РТПХ после удаления Т-клеток из клеточног! трансплантата ГСК возрастающий риск появления инфекций? Можно ли предсказать, у какого больного возникнут осложнения после трансплантации ГСК? Каков механизм посттрансплантационной ремиссии?

ГСК периферической крови: проблемы мобилизации из костного мозга. 1 Одним из самых обещающих методов использования ГСК для клеточной терапии является мобилизация, под которой понимают клинический процес! искусственно вызванного выброса ГСК и предшественников из костного мозга! в периферическую кровь с помощью химических агентов и цитокинов. Этот! процесс имитирует усиление физиологического выброса ГСК из костномозго­вого резервуара в ответ на стрессовые сигналы и во время тканевого поражения и воспаления.

В настоящее время мобилизованные клетки периферической крови рас-1 сматриваются как предпочтительный и главный источник ГСК, предназнаЯ ченных для аутологичных и аллогенных трансплантаций. Их применение приводит к более быстрому приживлению трансплантата и сниженикя процедурных рисков по сравнению с использованием костномозговых трансплантатов.

Мобилизация инициируется стресс-индуцированной активацией нейтрофи-1 лов и остеокластов в процессе химиотерапии и повторной стимуляцией! цитокинами, такими, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор! (G-CSF), в результате чего происходят высвобождение фактора стволовых! клеток (SCF), связанного с мембранами, пролиферация ГСК и предшествен-1 ников, а также активация и/или деградация адгезивных молекул, таких, как! VLA-4 и Р/Е селектины. Главные события, обеспечивающие отмену удержания I ГСК в костномозговой нише, включают секрецию, а затем инактивацию I хемокинов (SDF-1/CXCL12 и IL-8/CXCL8) протеолитическими энзимами,» такими, как эластаза, катепсин G, протеиназа 3, CD26 и различные матриксныеЯ

I

таЛлопротеиназы. Множественные стресс-сигналы возникают, например,

время воспаления и тканевого повреждения. Как следствие возникает лейкоцитоз, включающий повышенный уровень ранних предшественников с фенотипом CD34+/CD38+, обусловленный выбросом клеток из костного мозга. дтот выброс индуцируется в клинике и в экспериментальных моделях на животных широким спектром молекул и процедур: повреждение ДНК, химиотерапевтические препараты, такие, как циклофосфамид, комбинация яфосфамида, карбоплатина и этопозида, цитокины (G-CSF, GM-CSF, SCF, flt-3 ligand) и хемокины (IL-8, Mip-lp\ Grooc, SDF-1) [40].

G-CSF, наиболее часто применяемый иммобилизационный агент, обычно назначается ежедневно в дозе 5—10 мкг/кг в течение 5—10 дней самостоятельно или после химиотерапии. Однако у значительного количества больных, особенно подвергающихся экстенсивной химиотерапии, приводящей к аплазии костного мозга, пожилых пациентов и части здоровых людей отличается плохая мобилизация ГСК [41]. Кроме того, некоторым больным для успешной мобилизации необходимо приостановить введение лекарства во время мобилизационного процесса и добавить SCF к G-CSF [42]. Однако SCF может вызывать побочный эффект в виде аллергических реакций, поскольку помимо мобилизации СБ34-клеток он активирует тучные клетки.

Пластичность ГСК: эксперименты "за" и "против".

Наиболее впечатляющим свойством ГСК, с которым связывают заман­чивые перспективы клеточной репаративной терапии, без сомнения, является пластичность ГСК, т. е. способность превращаться в другие типы клеток при соответствующих условиях [43]. Так, в экспериментах на грызунах была показана способность ГСК дифференцироваться в скелетные мышцы, кар-диомиоциты, нейроны, клетки печени, клетки эндотелия и эпителия [44—48]. Однако вскоре появились работы, не подтвердившие эти данные. Так, недавно в журнале "Nature" был опубликован ряд статей различных групп авторов, в которых приведены данные, отрицающие превращение ГСК в клетки сердеч­ной мышцы в модельных опытах инфаркта миокарда [49,50]. Более того, было доказано, что ГСК не участвуют в репарации некротизированной ткани, а подвергаются дифференцировке, сходной с обычным гемопоэтическим процессом, протекающим в костном мозге. Однако было также показано, что при экспериментальной модели инфаркта миокарда наблюдается трансдиф-ференцировка ГСК в предшественники эндотелиоцитов в сердечной мышце [51, 52]. Таким образом, вопрос о трансдифференцировке ГСК остается открытым.

ХоумингГСК.

Возникшее противоречие, возможно, снимается благодаря исследованиям Молекулярных механизмов хоуминга ГСК. Установлено, что введение хемокина SDF-1 в экспериментально ишимизированные участки сердца, мышцы конечности или головного мозга приводит к интенсивной миграции ГСК в зону повреждения, после чего последние дифференцируются в клетки тканевого микроокружения [53,54].

Изучаются и другие молекулы, образующиеся в месте повреждения и привлекающие ГСК. Перспективное направление в клеточной терапии ГСК—

35

это использование факторов, мобилизующих ГСК из костного мозга. К таки^ факторам относятся колониестимулирующие цитокины типа G-CSF и G]yr, CSF. Российские ученые интенсивно изучают возможность вовлечения я репарационный процесс собственных ГСК больного, например при инфаркте миокарда, путем стимуляции их выброса из костного мозга. Они считают, чти механизм мобилизационного действия G-CSF связан с тем, что он является функциональным антагонистом SDF-1, т. е. приводит к разобщению это™ хемокина с рецептором CXCR-4 на поверхности ГСК и, следовательно,» высвобождению ГСК из костного мозга [55]. Терапевтическое применение CD34+ ГСК.

Появление коммерческих технологий иммуномагнитной сепарации CD34+ клеток позволило начать клинические испытания очищенных ГСК при аутологичных и аллогенных трансплантациях. Особенно впечатляющие результаты получены при использовании таких клеток у больных аутоиммунш ными заболеваниями, такими, как множественный склероз, системный склерозе ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, системная красная волчанка, дерматомиозиты и тромбоцитопеническая пурпура [56].

С помощью этой новейшей технологии удалось существенно снизить число осложнений в виде РТПХ у больных лейкозом. Однако возникла новая проблема. У больных, которым проводили трансплантацию очищенных ГСКв чаще стали возникать осложнения в виде оппортунистических вирусным инфекций, в том числе вызываемых цитомегаловирусом, в результате возникшей иммунодепрессии.

Сопоставляя эти два факта, можно заключить, что введение чистош популяции ГСК в организм приводит к системной иммуносупрессии, которая в первом случае вызывает механизм аутотолерантности, а во втором—снижение! противоинфекционной резистентности. Иммуносупрессорная активность ГСК.

Первое упоминание о причастности ГСК и ранних предшественником

гемопоэза к натуральной (неспецифической) иммунной супрессии появилось!

в литературе в конце 80-х годов [57]. В течение последующего десятилетия!

было доказано, что натуральные супрессорные (NS) клетки костного мозга I

имеют фенотип CD34+ [58—63]. Было установлено, что CD34+NS-ioieTKH I

являются незрелыми клетками с отсутствием дифференцировочных маркеров I

Т-, В-лимфоцитов и макрофагов и обнаруживаются в больших количествах в I

костном мозге и селезенке при возникновении опухоли, а также после 1

тотальной гамма-иррадиации или обработки циклофосфамидом. Другой их!

отличительной особенностью является способность агглютинировать в!

присутствии лектинов WGA и SBA. Эти клетки также несут на поверхности I

общий рецептор для IL-3 и GM-CSF. Большая часть NS-клеток костного мозга I

имела фенотип С034+Тпу1-ЬЗМ4"Гуг2"Мас1,2,3-асиалоОМ~, но небольшая I

часть клеток несла дополнительно СОЗЗ-маркер. Эти клетки не прилипали к I

пластику, имели плавучую плотность 1,063—1,075 г/мл. Для CD34+ NS-клеток I

были характерны выраженное ингибирование функциональной активности CTL I

и NK-клеток, подавление эффекторных функций моноцитов и дендритных I

клеток, изменение состава секретируемых цитокинов в Тп-клетках, 1

36

лнпбирование антителообразования, подавление пролиферации опухолевых ^яеток и контроль дифференцировки в костном мозге. Более детальное яссмотрение работ, выполненных по CD34+ NS-клеткам, можно найти в литературе [64,65].

В Казахстане исследования натуральной супрессии были начаты в Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина (лаборатория молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии, заведующий профессор Н. Н. Беляев) около 20 лет назад и продолжаются в настоящее время. По данному направлению за этот период были выполнены исследования в рамках шести научных тем, опубликованы 52 работы, включая 12 в дальнем зарубежье, и защищены одна докторская и три кандидатские диссертации.

Исследования феномена натуральной костномозговой супрессии начались с изучения механизмов регуляции NS-клеток костного мозга негативными сигналами, исходящими из другой популяции костномозговых NS-клеток, названных нами контрсупрессорами. Путем изопикнического центрифуги­рования клеток костного мозга линейных мышей на градиентах плотностей перколла было получено шесть фракций со следующими плавучими плотностями: Фр. 1 = 1,033, Фр. 2 = 1,060, Фр. 3 = 1,076, Фр. 4 = 1,090, Фр. 5 = 1,10, Фр. 6 = 1,13 г/мл [66, 67]. Оказалось, что Фр. 4 содержала как супрессорные, так и контрсупрессорные клетки [68—70].

Позднее популяцию регуляторных клеток нам удалось выделить с помощью аффинного сорбента на основе гистамина и индуцировать гистамином продукцию специфического фактора, угнетающего активность NS-клеток [71— 72]. Нами было высказано предположение, что в костном мозге существует система регуляции активности NS-клеток, в которой позитивные сигналы представлены IL-3 и GM-CSF, а негативные—неким неизвестным фактором, индуцируемым эндогенным гистамином [73]. Исходя из этих и литературных данных, мы предположили, что DL-2- и гистаминактивируемые NS-клетки могут являться контрсупрессорами для обнаруженных ранее IL-3- и (или) GM-CSF-стимулируемых популяций NS-клеток.

Более детальный анализ супрессорной функции различных фракций и суб­фракций костного мозга показал, что наибольшей продукцией супрессорных факторов, индуцированной цитокинами (IL-2, IFNy, IL-3, GM-CSF), обладала Фр. 4. Используя метод проточной цитофлуориметрии, мы провели фенотипи-рование Фр. 4 на наличие дифференцировочных CD-маркеров (CD3—Т-клет-ки, CD 19—В-клетки, CD lip—моноциты, CD34—гемопоэтические стволовые клетки) [64]. Оказалось, что на мембране клеток Фр. 4 отсутствовали маркеры зрелых дифференцированных лимфоидных и миелоидных клеток, в то время как большинство клеток (73,5±2,8%) имели маркер ГСК и ранних пред­шественников (CD34+).

В связи с предполагаемой клеточной гетерогенностью Фр. 4 мы разделили ее на отдельные субфракции, обозначенные нами как NS1, NS2 и NS3, с Плавучими плотностями р,=1,08, р2=1,090 и 1,09<р3<1, Юг/мл соответственно. Фракции отличались друг от друга по продукции супрессорных факторов в ответ на воздействие различных индукторов [74] (рис. 2).

37

□ н/с ■ IL- 2 ■ I FNg а Гистамин ■ IL- 3 ■ GM- CSF

35 . :

30 ■ i f^T;i т

fill HIj

.5. NS1 T NS2 NS3

-10 i -* I I

Рис. 2. Спонтанная (н/с) и индуцированная (IL-2, IL-3, IFNy, GM-CSF, гистамин)

супрессорная активность NS1-, NS2- и ШЗ-субфракций.

По оси ординат: ИС — индекс супрессии пролиферации миеломных клеток линии PAI

в МТТ-тесте

Так, NS1 отвечала на IL-2, IFNr и гистамин, и не реагировала на IL-3 и I GM-CSF. NS2 отвечала лишь на IL-3 и GM-CSF, а NS3 - только на IL-2 и I GM-CSF. Ни одна из полученных фракций не показала спонтанной NS- ] активности.

Для более детального анализа маркеров ГСК на трех полученных I субфракциях мы использовали пару моноклональных антител, меченных двумя I различными флуоресцентными метками, одним из которых являлось антитело ] к CD34, а второе выявляло один из дополнительных маркеров ГСК (CD 117 — 1 рецептор фактора стволовых клеток SCF, CD133 — маркер плюрипотентных ] HSC, СГЗ123—рецептор к DL-3, CD135—рецептор к ростовому факторуранних промоноцитов, В-клеток и ГСК) (рис. 3).

Из рис. 3 видно, что как NS 1-фракция, так и NS3 состояла преимущественно из CD34+CD117+-клеток (рис. 3, Аи И). Однако если NS1 содержала в своем составе еще и CD34+CD133+-K/ieTKH (21,7%), то №3-фракция — нет (рис. 3, Б I и К). Таким образом, NS 1-фракция является более гетерогенной популяцией по составу стволовых маркеров, чем №3-фракция, хотя общей чертой этих двух фракций является отсутствие на них CD135. Это говорит о том, что клетки NS Г и №3-фракций являются гемопоэтическими стволовыми клетками или очень ранними предшественниками.

Иную картину в отношении CD 135 (Flk2/Flt3)-MapKepa показала NS2-фракция, которая на 74,6% состояла из CD34+CD135+-ioieTOK, на 46% — из клеток CD34+CD123+ и не имела в своем составе ни CD 117+-, ни CD 133+-клеток. 38

А Д И

Б_ Е СР117 К ,

-д. mm тш ■,. .м-. Hill ада—,, т* .i.--. ■ |у | ™— I I ii-ii.... i. ,,J. -w ■ " ■ ■■ ■ J '" ■ ' ' ' '

I:;.1к^ :::WL :: ж,

» Vfo ' ' '""■&•>'' • "L'tV ' tV " ' " "'J5» ' Vk* Yiy ' 10- ' " '' '" th ' " tb' *'<>■ ' "" '""iV

В ж CD 133 д ^

mjr* aav. Ж**т. | -шоч* 1 ?ш; fti*

s W1- Щ] ~_..З^Я^_ ~1ж.

■,'■„,.-'" ^17'jfel7,! 1"" IZ," "™!?I" ' "',~V^, *,?„, Utt' IP' «У W" ""'""'«»' ''',','_„ "

г з CP12Э м

CD 135

Рис. 3. Фенотипический анализ субфракций NS1, NS2 и NS3, полученных из Фр. 4

костного мозга мышей линии СВА. А—Г — фенотипические характеристики клеток

NSl-фракции; Д—3 — фенотипические характеристики Ш2-фракции;

И—М — фенотипические характеристики клеток ИЗЗ-фракции

Наличие только одного маркера мультипотентных гемопоэтических предшественников—CD34, а также присутствие на плазматической мембране таких рецепторов, как CD 135 и CD 123, свидетельствует о том, что эта фракция скорее всего состоит из ранних предшественников миеломоноцитарного ряда (вероятно, CFU-GM).

Принадлежность изучаемых нами NS-клеток к мультипотентным и унипо-тентным ГСК мы подтвердили по отсутствию маркеров коммитированных пред­шественников, локализованных в костном мозге (CD 10, IL-7R, TER-119 и CD33).

Таким образом, нам удалось выделить из костного мозга три фракции мышиных NS-клеток с плавучими плотностями 1,080 (NS1), 1,090 (NS2) и > 1,090 (NS3) г/мл, различающихся по чувствительности к известным индукторам (NS1 - к IL-2, IFN и гистамину; NS2 - к IL-3 и GM-CSF; NS3 - к IL-2 и GM-CSF). Все фракции NS-клеток имели фенотип ГСК (LhrCD34+) и различались

39





по степени зрелости (NS1 - CD117+CD133+, NS3 - CD117+, NS2 М CD123+CD135+CD33+).

Далее мы попытались охарактеризовать спектр факторов трех субфракций ГСК, опосредующих различные иммуносупрессорные эффекты, индуцируемые цитокинами и гастамином [75].

Исследование наличия TGFP в культуральном супернатанте субпопуляций NS-клеток проводили с помощью нейтрализации его биологической актив-) ности поликлональными антителами против мышиного TGF-p. Обработанный I антителами супернатант анализировался на наличие антипролиферативной активности.

Оказалось, что вся антипролиферативная активность, индуцированная каш IL-2, так и гастамином, в клетках NS 1-фракции была связана исключительно ! с TGFp. При действии IL-3 NS2-KfieTKH также секретировали только TGFp. I NS3-mieTKH, стимулированные IL-2, секретировали помимо TGFp какие-тоЯ другие супрессорные факторы.

Иммуноферментный анализ продуктов, секретируемых каждой фракцией ГСК (табл. 2), показал, что при воздействии IL-2 или гистамина на клетки 1 NS1 -фракции секретировался лишь TGFp.

Таблица 2 1 Продукция цитокинов различными фракциями NS/ГСК

под воздействием ряда индукторов
Фракции Индукторы Концентрация супрессорных факторов


TGF0, IL-6 IL-10 IL-13 Нитриты/нитраты

(пкг/мл) (пкг/мл) (пкг/мл) (пкг/мл) (мкМ/мл)

NS1 Н/с <15 <3 <13 <15 6,8±0,3

IL-2 1499,3±32,9 <3 <13 <1,5 16,2±1,3

Гистамин 906,6±15,7 <3 <13 <1,5 21,1±1,8 I

NS2 Н/с <15 <3 <13 <1,5 <3

IL-3 1259,0±32,2 <3 <13 <1,5 27,3±1,7

NS3 Н/с <15 <3 <13 <1,5 5,3±0,4

IL-2 458,8±25,7 264,8±22,7 <13 324,1±8,2 10,2±0,4

Кроме того, также были выявлены продукты метаболизма NO (нитриты и нитраты), определяемые с помощью реакции Грисса, что свидетельствует о стимуляции продукции N0. При стимуляции №2-клеток IL-3 также секрета- 1 ровался только TGFp. Кроме того, клетки одновременно секретировали боль­шое количество N0. Анализ IL-2-зависимой продукции супрессорных фак- I торов №3-клетками выявил, что помимо TGFp клетки секретировали IL-6 и ] IL-13, а также генерировали оксид азота.

Для оценки роли обнаруженных потенциальных супрессорных факторов в
еГудяции активности NK-клеток и CTL, а также в Th 1 /Тп2-переключении

мы провели нейтрализационный анализ, используя соответствующие тест-$ сцстемы культивируемых клеток ex vivo и антитела к TGFp, IL-10, IL-13 и IL-6, ie а также L-N-иминоэтил-гидрохлорид (L-NIL) в качестве ингибитора индуци-

бильной NO-синтазы (iNOS).
й В случае, когда использование антител или L-NIL в отдельности не приво-

|- ддао к полной отмене действия супрессорных факторов, проводили совместное
й в0здействие и антителами, и L-NIL [64].
й Важнейшими эффекторными клетками противоопухолевого иммунитета

считаются натуральные киллерные (NK) клетки и цитотоксические < х-лимфоциты (CTL). Мы получили популяции NK-клеток и CTL (из суспензии з спленоцитов мышей линии СВ А с помощью иммуномагнитной сепарации) и

воздействовали на них супернатантами клеточных культур трех NS-фракций, ) стимулированных соответствующими индукторами. Обработанные таким

образом киллерные клетки испытывали в цитотоксическом тесте, используя
i в качестве мишеней клетки человеческой эритролейкемии К-562 и мышиной

i мастоцитомы Р815.

Кроме того, мы провели исследование влияния секретируемых NS/ГСК-фак-

1 торов на продукцию цитокинов 1-го и 2-го типов CD4+ Т-клетками, выделенными из мононуклеарной фракции клеток селезенки мышей линии СВА с помощью иммуномагнитной сепарации. Количество клеток, содер­жащих IFNy (1-й тип цитокинов) или IL-4 (2-й тип цитокинов), определяли с помощью проточной цитофлуориметрии, используя моноклональные антитела к данным цитокинам, меченные различными флуорохромами. Как известно, соотношение Т-хелперов Thl/Th2 очень важно для регуляции фаз иммунного ответа. По литературным данным, при опухолевом процессе это соотношение

I сдвигается в сторону уменьшения активности ТЫ- и усиления Тп2-клеток. Оказалось, что применяемые индукторы вызывают продукцию NS-клетками факторов, существенно снижающих цитолитическую активность NK и CTL, а также вызывают в NS/ГСК продукцию факторов, снижающих в Т-хелперах уровень IFNy и повышающих уровень IL-4, т. е. осуществляют иммунологический свитчинг в сторону образования Тп2-клеток. Причем супрессорньш эффект NS 1-клеток на CTL и NK-клетки был связан полностью с продукцией TGFp. ТЫ/ГМ-переключение, вызываемое продуктами NS1-клеток, также зависело от TGFp. NO усиливало этот процесс. Супрессорные и регуляторные эффекты супернатантов №2-клеток, стимулированных IL-3, были связаны исключительно с присутствием в них TGFp и N0, причем в большей степени—TGFp. Очевидно, это связано с высоким уровнем продукции TGFp клетками №2-фракции. Анализ роли различных цитокинов и N0, продуцируемых №3-клетками в ответ на воздействие IL-2, в опосредовании супрессорных эффектов показал, что в угнетении цитолитической активности NK-клеток участвуют TGFp, IL-6 и IL-13. Торможение CTL-активности было связано только с TGFP и N0. Ни IL-6, ни IL-13 в выделяемых NS3-ioieTKaMH Количествах никак не влияли на цитолитическую активность CTL. Проведенные нами эксперименты позволили утверждать, что ГСК и ранние Предшественники костного мозга обладают индуцибельной натуральной

иммуносупрессорной активностью, включающей торможение пролиферации I лимфоидных клеток, торможение цитолитической активности NK-клеток и I CTL, а также переключение в Т-хелперных клетках продукции цитокинов с I Th 1-типа на Тгг2-тип. Иммуносупрессорная активность ГСК, индуцированная I IL-2 и гистамином (NS1), IL-3 (NS2) или IL-2 (NS3), осуществляется через! продукцию супрессорных цитокинов (TGF(3, IL-6 и IL-13) и оксида азота. Роль I каждой фракции NS/TCK в естественной регуляции иммунной системы при различных патологических состояниях предстоит выяснить. Но уже сейчас I можно предположить, что появление в кровотоке больших количеств ГСК, I мобилизованных из костного мозга, должно сопровождаться системной I иммуносупрессией. Возможно, именно этим объясняется повышение частоты I возникновения оппортунистических инфекционных процессов послеЯ аллогенных и аутологичных трансплантаций ГСК.

К обоснованию клеточно-мобилизационной терапии хирургически» болезней.

Обнаружение феномена пластичности у ГСК, заключающегося в способ-И ности этих клеток дифференцироваться в типы клеток, не связанные с! миелолимфоидным фенотипом, инициировало взрыв исследовательского^ интереса к возможности восстановления поврежденных патологическими процессом или травмой тканей жизненно важных органов, таких, как сердцеД печень, легкие. Ряд экспериментальных работ, проведенных на животных"] доказавших несомненность регенерационного потенциала ГСК, выделенных I из костного мозга или мобилизованных из него с помощью колониестимули-И рующих факторов, привел к появлению новой концепции восстановительной I терапии поврежденных тканей, в основе которой лежит принцип соблюдения I естественных механизмов клеточной репарации. Предполагаемый механизм заключается в том, что любая гибель клеток, связанная с травмой (в том числе хирургической) или патологическим процессом, включая инфекционное и, неинфекционное воспаление, инфаркт (например, вызванный ишемией),' инсульт и т.п., приводит к выделению в кровь из очага тканевого повреждения ряда факторов, обладающих мобилизующими свойствами в отношении ГСК костного мозга. ГСК покидают свою естественную нишу в костном мозге и перемещаются с кровотоком в область повреждения за счет хоуминга (направ-ленного перемещения), обусловленного рядом факторов, образующихся в поврежденном участке, в частности SDF-1, к которому на ГСК имеются рецеп-торы. В результате в очаге повреждения скапливаются ГСК, которые осу- •! ществляют репарацию поврежденной ткани. На сегодняшний день существуют три гипотезы, объясняющие данный процесс: 1) трансдифференцировка ГСК в несвойственный для этих клеток, обитающих в костном мозге, фенотип I (кардиомиоциты, эндотелиоциты, гепатоциты, нервные клетки и др.); 2) слияние I с неповрежденными клетками с последующим делением и образованием новой I ткани; 3) дифференцировка малочисленных особых субпопуляций ГСК/пред- I шественников, уже коммитированных в костном мозге в сторону образования I зрелых клеток, присущих поврежденной ткани. В любом случае эксперимен-1 тальные находки нуждаются в подтверждении и, самое главное, в доказательстве I существования феномена естественной клеточной репарации у человека.

r настоящее время репаративный эффект ГСК у человека пытаются полу­ют, путем использования нескольких методических подходов: 1) аутологичные ддлогенные трансплантации костного мозга и ГСК, выделенных из него; 91 аллогенные трансплантации ГСК, выделенных из пуповинной крови; т.) аутологичные трансплантации ГСК, выделенных из собственной перифери­ческой крови после лейкофереза, и 4) мобилизация собственных ГСК из костного мозга путем введения рекомбинантных препаратов колониести-мулирующих факторов G-CSF и GM-CSF.

Нас заинтересовал метод мобилизации собственных ГСК в связи с возмож­ностью влиять на процессы тканевой репарации после проведения обширных хирУРгических операций. Наиболее часто для мобилизации ГСК из костного мозга используют нейпоген, или филграстим, рекомбинантный G-CSF, применяемый в онкологии для восстановления нормального кроветворения после химиотерапии. Препарат зарегистрирован в Казахстане, хорошо переносится пациентами, вызывая десятикратное повышение ГСК в циркулирующей крови.

По современным представлениям, скорость заживления хирургических ран зависит от регенерационных способностей стволовых кроветворных клеток у конкретного больного и может регулироваться введением специальных фак­торов. Однако до сих пор неизвестны роль и степень участия полипотентных гемопоэтических стволовых клеток в процессах репарации оперируемых органов и тканей. Как правило, оперируемые органы содержат зоны тканевого некроза, вносящего существенный вклад в формирование органной недостаточности, т. е. нуждаются в клеточной регенерации.

С другой стороны, известно, что операционный стресс приводит к угнетению в послеоперационном периоде иммунитета (вторичное иммунодефицитное состояние), что, в свою очередь, может вызывать тяжелые гнойно-воспа­лительные осложнения. При этом важное значение имеют характер патологии и объем хирургического лечения, степень тяжести интраоперационной травмы (время операции, объем кровопотери, болевой синдром и т.д.), возраст больного, состояние иммунитета до операции. Ситуация осложняется тем, что у хирургических больных, как правило, иммунная система находится уже в состоянии угнетения, вызванного длительностью органного заболевания. Считается, что первостепенное значение в возникновении послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений принадлежит иммунобиологическим Факторам, на 70% определяющим исход хирургического лечения.

Современный подход к проблеме повышения уровня иммунологической Реактивности у больного перед операцией заключается в использовании иммуностимулятора "интерлейкин-2" (IL-2), в качестве которого используют Рекомбинантный IL-2 (российский препарат "ронколейкин", зарегистриро-ванный в Казахстане). В настоящее время ронколейкин входит в список Жизненно важных лекарственных средств в РК и хорошо зарекомендовал себя в Качестве мощного иммуностимулирующего средства, восстанавливающего Иммунную систему, угнетенную инфекционным процессом, в том числе при трых и хронических септических состояниях [76].

Таким образом, к настоящему моменту сложились теоретические и

43




экспериментально-клинические предпосылки для направленного воздействия на систему стволовых клеток костного мозга и иммунитет с целью осуществления тканевой и органной репарации при использовании достижений генной инженерии—препаратов рекомбинантных цитокинов.

Принципиальная схема событий, возникающих при операционном стресс™ с участием ГСК, и путей фармакологической коррекции репаративного процесса и иммунного статуса представлена на рис. 4.

В области оперативного вмешательства высвобождаются факторы хоуминга, в частности хемокин SDF-1, которые вызывают специфическую хемоаттракцию ГСК, перманентно циркулирующих в крови. Введение филграстима будет усиливать мобилизацию ГСК из костного мозга и тем самым повышать уровень ГСК, прибывающих в зону тканевого повреждения. Под влиянием неизвестного процесса ГСК трансформируются в клетки поврежв денной ткани. Одновременно ГСК ингибируют любую иммунологическую активность иммунокомпетентных клеток, оказавшихся в раневой зоне. Этим самым ограничивается воспалительный процесс, который объективно препят-И ствует репарации ткани. Повышенное содержание ГСК с натуральной супрес- j сорной активностью в циркуляции может приводить к системному сдвигу иммунного равновесия в сторону Тп2-типа, что объективно будет способствоЯ вать развитию инфекционного процесса. С целью коррекции иммунного статуса необходимо вводить стимулятор иммунитета—IL-2 в виде фармакологического препарата "ронколейкин".

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


Учебный материал
© bib.convdocs.org
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации