Алиев. Современные клеточные технологии в медицине - файл n1.doc

Алиев. Современные клеточные технологии в медицине
скачать (1468 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc1468kb.21.10.2012 09:57скачать

n1.doc

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
_■

-j /\ I

jj/iej^ Иммунная систем л к Стимуляция] Ронколейкин 4f ^^И/овтс^пердтивногоЛ

****** ^^Ч I

Филграстим L ZZ|j>- Щ Ш Г

^^^ Мобила***^ I

I _ I

Рис. 4. Схема клеточно-мобилизационной цитокинотерапии хирургических осложнений

44

Таким образом, проблема иммунной и органной недостаточности у

ургических больных в совокупности с проблемой постхирургических

сложнений диктует необходимость разработки новых подходов лечения и

0фИлактики, основанных на новейших иммунобиологических технологиях,

частности использовании эндогенных стволовых клеток и экзогенных

цитокинов.

Мы поставили цель изучить участие ГСК и факторов, регулирующих их активность, а также состояние иммунной системы в ходе восстановительного процесса после хирургической операции.

Оценка уровня основных субпопуляций клеток иммунной системы.

Исследовали две группы больных: опытная группа (10 человек) — больные, подвергшиеся аортокоронарному шунтированию, контрольная группа (17 че­ловек) —больные, подвергшиеся стентированию коронарных сосудов в отделе­нии кардиохирургии Научного центра хирургии им. А. Н. Сызганова МЗ РК.

Исследовали иммун­
ный статус больных до и ~Т"Ж

операции а После операции D В момент выписки |

после хирургического м

вмешательства в различ- 80.
ные сроки, оценивая ■• то ^ш~
субпопуляционный сое- | 60 ■ I ■_
тав иммунокомпетент­
ных клеток по CD-мар- f зо - I m -I
керам, а также продеку- ° го - I

циюцитокинов. ю-1 ИЦП BLn i

Результаты оценки ° ' ^^

■* М CD3 CD4 CD8 CD19 CD16/56

уровня основных попу- I

ляций иммунокомпе­
тентных клеток в кон­
трольной и опытной _=и=_==_=_=__=_=====_==_==___1

Группах ПреДСТаВЛеНЫ На ]'Д° операции в После операции а В момент выписки]

рис. 5 и б). 80

Как видно из 70 ^^~~

рж. 5, а, процедура стен- ^ во- I иГ

тирования не повлияла | 50" I

на существенное измене- |40 I

ние популяционного | 30 "

состава периферической ° 20" Шй ш

крови. Снижение сред- 10 Щ~\

НИХ ДаННЫХ ПО В-ЛИМфО- CD3 C04 CD8 CD19 CD16/56

Цитам (CD19) и NK-клет- I 1

кам (CD 16/56) в первые б

сутки после процедуры

было незначимо Не- *>ис- '• Содержание основных популяций

СКОЛЬКО иная каотина иммунокомпетентных клеток в периферической крови у

Наблюдалась В ОПЫТНОЙ больных с ИБС до и после операции стентирования (а)

группе (рис. 5, б). В этом или аортокоронарного шунтирования (б)

I

случае наблюдалось достоверное снижение (Р= 0,048) количества цитотоксц. ческих СВ8+-клеток к моменту выписки больных из стационара (8-й — 1(Ц день). Изменение остальных показателей были незначимо.

Оценка уровня CD34+ гемопоэтических стволовых клеток.

Наибольший интерес представляла динамика изменения уровня циркули J рующих ГСК в крови после операции. На рис. 6 представлены данные такого анализа при сравнении опытной и контрольной групп, принципиально различающихся объемом хирургического вмешательства.

Как видно из рис. 6, исходное содержание ГСК в обеих группах былся одинаковым. Стентирование никак не влияло на изменение этого уровня (увеличение средних значений в два раза сразу после процедуры стентирования I незначимо). В опытной группе наблюдалось достоверное увеличение количества циркулирующих ГСК в 3,2 раза (по средним цифрам).

Оценка уровня цитокинов в сыворотке крови.

Для того чтобы получить как можно более полное представление о возможя ном иммунорегуляторном дисбалансе, мы оценивали несколько групп цитокинов.

Группа провоспалительных цитокинов. Мы оценивали содержание IL-1р и TNFa как основных медиаторов иммунного воспаления (рис. 7,8).

Анализ полученных данных показывает, что как в контрольной, так и я опытной группах отсутствует различие в содержании основных провоспали-1 тельных цитокинов до и после лечения.

Группа супрессорных цитокинов. Известно, что супрессорными по othoJ шению к врожденному и адаптивному иммунитетам являются интерлейкины 6 и 10, а также росттрансформирующий фактор "бета" (TGFp). Мы проанализи-1 ровали динамику изменения их уровней в обеих группах (рис. 9—11).

■ До операции и После операции □ В момент выписки

3 _ , . — . . .—.—,

% 2,5 -

о

1 (НН

Контроль Опыт

Рис. 6. Динамика содержания CD34+ гемопоэтических стволовых клеток в периферической крови у больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) I или аортокоронарного шунтирования (опыт)

80 т '

70-

5 |оВ момент выписки!

а х

IL-1 Р TNF а

Рис. 7. Уровень провоспалительных цитокинов (IL-lb, TNFa) в сыворотке крови больных с ИБС до и после стентирования

Как видно из рис. 9, уровень IL-6 значимо не менялся в ходе лечения у больных контрольной группы, тогда как в опытной группе наблюдалось достоверное снижение его повышенного уровня до нормы в первый день после операции и в момент выписки.

На рис. 10 показана динамика изменения уровня IL-10, из которой следует, что у больных контрольной группы IL-10 обнаруживается в следовых количествах и его уровень не меняется в процессе лечения. В опытной группе наблюдается достоверное (Р= 0,024) увеличение его уровня в 16,8 раза через

60 __ _ ., _ , __ _ _

50- _

= 40-

5 о9 момент выписки

t" I I 1

"j ^И 1 И

up тара

Рис. 8. Уровень провоспалительных цитокинов (IL-ip, TNFa) в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции аортокоронарного шунтирования

47





1

20 -. 1

18-

16- |

| 1* " , j


g 10- ■ После операции

В g DВ момент выписки

I е- I

о ИИ

Контроль Опыт

, , ~*~^ви

Рис. 9. Уровень IL-6 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

сутки после АКШ, а к моменту выписки снижается у части больных до исходного уровня. Этот факт можно расценить как проявление иммуносупрес-сорной тенденции, вызванной операционным стрессом.

Анализ содержания супрессорного цитокина TGF(3 в обоих группах не вьш явил никаких изменений его уровня в ходе хирургического лечения (рис. 11)Я

Активационные цитокины. Следующим цитокином, проанализированным нами, был IL-15, действие которого аналогично действию IL-2, однако ва

7

6 -5 -

i4_ г i i 1

jf ИДо операции

Я 3- т ■ После операции

В D В момент выписки

О MBBHI 1 1 ■■■■■■■■ 1

Контроль Опыт

-1 -I ■—■ ■ ■—-— —■ ■

Рис. 10. Уровень IL-10 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)
Г

1400 -, — ——

ох 800- ■ До операции

5 В После операции

а 600 ' DB момент выписки

«»■ И И 1

Контроль Опыт

Рис. 11. Уровень TGF|3 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

отличие от него IL-15 является более эффективным стимулятором NK-клеток, а следовательно, и противовирусного иммунитета (рис. 12).

Как видно из рис. 12, в контрольной группе средний уровень этого цитокина не менялся в ходе лечения, хотя высокая дисперсия свидетельствует о широком

120 -I ^ 1

100 - т Т т

IS T"

=| И Я— I Т

I 60 - ■ I I ■ До операции

а. И— | ■ После операции

I D В момент выписки

? 40 - ' '

5 I

20 -

I I

0 -I—"^ 1—,—■^■^■в 1—

Контроль Опыт

Рис. 12. Уровень IL-15 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

49

8 25 -

к "До операми

§■ " ■ После операции

Ј■ -1С . ОВмоментвыписки

5 -

Ш I

о -I—^ии»-—i—,—^тшы—i—

Контроль Опыт

Рис. 13. Уровень G-CSF в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

варьировании этого показателя у индивидуальных больных. В опытной группе отмечалось снижение средней величины показателя в первые сутки после операции. Однако из-за высокого варьирования результатов различие это недостоверно.

80 -I 1

70 - у

5 60 - т

| Т 1 После операции

Ј■ on [XT ОВмоментвыписки

Контроль Опыт

Рис. 14. Уровень SCF в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт) 50

Стимуляторы ГСК. Далее мы исследовали содержание в крови гемопоэти-еских факторов, полагая, что их уровень отражает состояние гемопоэза и мобилизации гемопоэтических стволовых клеток. Данные по оценке уровня Q-CSF и SCF представлены на рис. 13 и 14 соответственно.

Как следует из рис. 13, в контрольной группе не было значимых изменений

уровне G-CSF в динамике лечения. В опытной же группе наблюдалось

существенное (Р = 0,044) повышение (в 2,6 раза) уровня этого цитокина в

первые сутки после операции. К моменту выписки его уровень снижался до

исходного состояния.

Результаты анализа содержания SCF (рис. 14) показали, что в обеих группах отмечалось широкое варьирование результатов, но статистически значимых изменений среднего уровня этого цитокина в ходе лечения обнаружено не было.

Оценка функциональной активности Т-клеток.

Для оценки функциональной активности Т-клеток мы использовали хорошо зарекомендовавший себя тест СопА-индуцированной пролиферации мононуклеарных клеток (рис. 15).

Как показал анализ, в контрольной группе пролиферативная активность Т-лимфоцитов не изменялась в ходе лечения. В опытной группе отмечалась тенденция к снижению этой активности в первые сутки после операции (Р = 0,061), что может свидетельствовать о снижении напряженности Т-кле-точной системы у большинства больных под действием операционного стресса.

В следующем эксперименте мы оценили продукцию цитокинов 1-го и 2-го типов Т-клетками под действием митогена СопА у больных обеих групп в ходе лечения (рис. 16).

■ До операми Я После операции D В момент выписки

250 1 ^ -|

Контроль Опыт

Рис. 15. Пролиферативная активность Т-клеток периферической крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования

(опыт)

51




■ До операции ■ После операции □ В момент выписки

900 -. "' -.

| 800 -Ј 700 -^- 600 -

i::r ±k~i l Г]

|S: ■ Щ^. I

с \ Ш I ш ,

Контроль Опыт

Рис. 16. Продукция IFNy Т-клетками периферической крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт) 1

Как видно из рис. 16, картина продукции цитокина 1-го типа похожа на картину пролиферативной активности Т-клеток. Хотя достоверных изменений в уровне продукции не наблюдается в обеих группах, динамика изменения пролиферативной активности в опытной группе высоко коррелирует с уровнем продукции IFNy, что может свидетельствовать о негативном влиянии операционного стресса на функциональную активность ТЫ-клеточного иммунитета.

Что касается продукции IL-4, цитокина 2-го типа, то его образование не было обнаружено ни в одном из образцов крови как в контрольной, так и Л опытной группах, что свидетельствует о том, что Тп2-тип реагирования не характерен для данных групп больных, а процедура стентирования и АКШ не влияют на его появление.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить следующие значимые изменения в иммунной системе, оцениваемой по периферической крови:

1

гемопоэтических клеток с фенотипом CD34+ в 3,2 раза к 8—10-му дню после операции. • На 2-е сутки после хирургической операции в крови происходит транзи-торное увеличение цитокина G-CSF - фактора мобилизации гемопоэти­ческих стволовых клеток из костного мозга.

Полученные нами данные подтверждают наше предположение о повышении мобилизации ГСК из костного мозга в кровь при хирургической операции при одновременном снижении напряженности иммунитета. Обращает на себя вни­мание тот факт, что повышение уровня мобилизационного фактора G-CSF наблюдалось в первый день после операции, а подъем уровня циркулирующих гСК _ к моменту выписки, когда уровень G-CSF снизился до исходного состояния. Считая, что уровни G-CSF и ГСК тесно связаны между собой и что подъем первого является причиной подъема второго, можно заключить, что в целях усиления вовлечения мобилизованных ГСК в репарационный процесс необходимо начинать вводить больным G-CSF (филграстим) за несколько дней до операции, повысив уровень циркулирующих ГСК в несколько раз до начала операции.

Что касается активации иммунитета ронколейкином, то, судя по транзитор­ному подъему супрессорного цитокина IL-10 и снижению уровня цитокси-ческих Т-лимфоцитов сразу после операции, его целесообразно вводить в пер­вые три дня после операции для предотвращения инфекционных осложнений.

Литература

1. Weissman I.L. Translating stem and progenitor cell Biology to the clinic: Barriers and
opportunities // Science, 2000. V. 287. P. 1442-1446.

2. Melchers F, Relink A. Hematopoietic stem cells: Lymphopoiesis and the problem of
commitment versus plasticity// Stem Cell Biology, Ed. Marshak D.R., Gardner R.L.,
Gottlieb D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. P. 307—327.

3. Morrison S.J., Shah N.M., Anderson D.J. Regulatory mechanisms in stem cell biology/
/Cell, 1997. V. 88. P. 287-298.

4. Lemischka I.R., Raulet D.H., Mulligan R.C. Developmental potential and dynamic
behavior of hematopoietic stem cells//Cell, 1986. V. 45. P. 917-927.

5. Cheshier S.H., Morrison SJ., Liao X., Weissman I.L // Proc. Natl. Acad. Sci., 1999.
V. 96. P. 3120-3125.

6- Relink A., HaasnerD., Nishikawa SJ, Melchers F. Changes in frequencies of clonable
preB cells during life in different lymphoid organs of mice//Blood., 1993. V. 81. P. 2290—
2300.

7- Ma Q., Jones D., Springer N.A. The chemokine receptor CXCR4 is required for the
retention of В lineage and granulocytic precursors within the bone marrow
microenvironment//Immunity, 1999. V. 10. P. 463—471.

8- PotocnikA. Role of bl integrin for hemato-lymphopoiesis in mouse development//
Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2000. V. 251. P. 43-50.

9- Spangrude G.J., Heimfeld S., Weissman I.L. Purification and characterization of mouse
hematopoietic stem cells//Science, 1988. V. 241. P. 58-62.

10- Spangrude G.J., Brooks DM Mouse strain variability in the expression in the hemato-

LPoietic stem cell antigen Ly6A/E by bone marrow//Blood, 1993. V. 82. P. 3327—3332.

  1. Sato T., LaverJ.H., Ogawa M. Reversible expression of CD34 by murine hematon ■ stem cells//Blood, 1999. V. 94. P. 2548-2554. et'c

  2. Martin-Rendon E., Watt S. Stem cell plasticity//Brit. J. Haematol, 2003. V \r>t P. 877-899.

  3. Bonnet D. Haemopoietic stem cells // J. Pathol, 2002. V. 197 (4). P. 430-440.

  4. Terstappen L. W., HuangS., SaffordM., Lansdorp P.M., Loken M.R. Sequential gene tions of hemopoietic colonies derived from single nonlineage-committed CD34+cp)-iJ progenitor cells//Blood, 1991. V. 77. P. 1218-1227.

  5. Andrews R.G., Singer J. W., Bernstein ID. Precursors of colony-forming cells in human can be distinguished from colony-forming cells by expression of the CD33 and CD34 antigens and light scatter properties // J. Exp. Med., 1989. V. 169. P. 1721—1731. I

  6. Lansdorp P.M., SutherlandH.J., Eaves C.J. Selective expression of CD45 isoforrns on functional subpopulations of CD34+ hemopoietic cells from human bone marrow// J. Exp. Med., 1990. V. 172. P. 363-366.

  7. Craig W., KayR., CulterR.L., Lansdorp P.M. Expression of Thy-1 on human hemopoietic progenitor cells//J. Exp. Med., 1993. V. 177. P. 1331-1342.

  8. YinA.H.,MigagliaS.,ZanjaniE.D.,Almeida-PoradaG., OgawaM., LearyA.G.,Olweus J. RearneyJ., BuckD. W. AC 133, a novel marker for human bone marrow hemopoietic stem and progenitor cells // Blood, 1997. V. 90. P. 5002-5012.

  9. Bhatia M., Bonnet D., Murdoch В., Gan O.L., Dick J.E. A newly discovered class of human hemopoietic cells with SCID-repopulating activity // Nat. Med., 1998. V. 4. P. 1038-1045.

  10. KuciS., WesselsJ., BuhringHJ., SchilbachK., SchummM., Seitz G., LofflerJ., BaderP., SchleigelP.G., Neithammer D., Hangreitinger R. Identification of novel class of human adherent CD34" stem cells that give rise to SCID-repopulating cells//Blood, 2003. V. 101 (3). P. 869-876.

  11. Martin-Rendon E., WattS.M. Exploitation of stem cell plasticity // Transfusion Medi­cine, 2003. V. 13. P. 325-349.

  12. Immunology, Ed. RoittL, BrostoffJ., MaleD., Mosby, Edinburgh e.a., 2001.

  13. Thomas E.D., Storb R. Technique for human marrow grafting // Blood, 1970. V. 36. P. 192-204.

  14. Horowitz M.M. Uses and growth of hematopoietic cell transplantation//Hematopoietioc cell transplantation, Thomas E.D., Blume K.G., Harman S.J., Eds, 2nd edition. Maiden, MA: Blackell Science, 1999. P. 12-18.

  15. Storb R.F., Lucarelli G., McSweeney PA., ChildsR. W. Hematopoietic cell transplanta­tion for benign hematopoietical disorders and solid tumors // Hematology, 2003. P. 372— 397.

  16. MaleD. T-cell receptors and major histocompatibility complex molecules//Irnmun°" logy, Ed. Roitt I., BrostoffJ., Maie D., Mosby, Edinburgh e.a., 2001. P. 87-103.

  17. Martin P.J., Hansen J.A., Thomas E.D. Human marrow transplantation: an imrrm110 logical perspective//Adv. Immunol, 1987. V. 40. P. 379-438.

  18. Buckley R.B. Transplantation immunology: Organ and bone marrow//J. Allegyt-Immunol, 2003. V. 111. N 2. P. S733-S744.

  19. Read EJ., Carter Ch.S. T-cell depletion of hematopietic progenitor cell products ° allogenic transplantation//Cellular Therapy: New Frontiers in Transfusion M cine, Ed. Sacher R.A., Bethesda, MD: American Association of Blood Banks. *

P. 29-44.

54

U Harousseau J.L., Stoppa A.M., Sotto J.J., Fuzibet J.G., Rossi J.E., Casassus P.,

' . meuveH., Facon T, If rah N., Payen C, BataileR. A prospective, randomized trial

^ rologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma.

logous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma //

AUEngl- •>■ Med'' 1996- V- 335' P- 91~105-. tG GazittY.,LeemhuisT.,JagannathS.,DesikanK.R.,SiegelD.,FassasA., TindleS.,

3'- , 1 nrtJ., Juttner C, Tsukamoto A., Hallagan J., Atkinson K., Reading C, Hoffman R.,

InzieB. Collection, tumor contamination and engraftment kinetics of higly purified

topoietic pr0genitor сец to support high dose therapy in multiple mieloma //

Blood. 1998. V. 91. P. 4489-^1495.

. ug j)J.L. Autologous bone-marrow transplantation for rheumatoid arthritis (let-

32 iter) //Lancet, 1997. V. 350. P. 337-339; BurtR.K., TraynorA.E, Ramsey-GoldmanR. Hematopoietic stem cell transplantation for systemic lupus erythematosus (letter)// N. Engl- J. Med., 1997. V. 337. P. 1777-1779.

-n fyndallA., Black C, FinkeJ., Winkler J., Mertlesmann R., Peter H.H., Gartwohl A. Treatment of systemic sclerosis with autologous hematopoietic stem cell transplanta­tion (letter) // Lancet, 1997. V. 349. P. 254-255;

34 BurtR.K-, TraynorA.E., Cohen В., Karlin K.H., Davis FA., Stefoski D., Terry C.,Lobeck L., Russel E.J., Goolsby C, Rosen S., Gordon L.I., Keever-Taylor C, Burns W.H. T-cell depleted autologoushematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis: Re­port on the first three patients//Bone Marrow Transplant. 1997. V. 21. P. 537—542.

  1. Burt R.K., Traynor A.E., Pope R., Schroeder J., Cohen В., Karlin KM., Lobeck L., Goolsby Ch., Rowlings Ph., Davis F., Stefoski D., Terry C, Keever-Taylor C, Rosen S., Vesole D., Fishman M., Brush M., Mujias S., Villa M., Burns W.H. Treatment of autoimmune diseases by intense immunosuppressive conditioning and autologous hematopoietic stem cell transplantation // Blood, 1998. V. 92. P. 3505—3514.

  2. TyndalA., Passweg J., Grathwohl A. Haemopoietic stem cell transplantation in the treatment of severe autoimmune diseases 2000//Ann. Rheum. Dis., 2001. V. 60. P. 702-707.

  3. Tyndal A., Passweg J., Grathwohl A. Haemopoietic stem cell transplantation in the treatment of severe autoimmune diseases 2000 // Ann. Rheum. Dis., 2001. V. 60. P. 702-707.

ourt R.K., Slavin S., Bums W., Marmont A. Induction of tolerance in autoimmune diseases by hematopoietic stem cell transplantation: getting closer to cure? // Blood, 39 V. 99. P. 768-784.

• *a< Sh., Нага Н. Allogenic hematopoietic stem cell transplantation // Therapeutic 4Q Apheresis and Dialysis, 2003. V. 7(3). P. 285-291.

opidot Т., Petit L Current understanding of stem cell mobilization: the roles of ernokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells // 41 у Hematol> 2002. V. 30. P. 973-981.

orris C.L., SiegelE., BarlogieB. et al. Mobilization of CD34+ cells in elderly patients /~/0 years) with multiple myeloma: influence of age, prior therapy, platelet count 42. fj mobiHzation regimen // Br. J. Haematol, 2003. V. 120. P. 413^123.

With г ^°^ ^' ^' Wh'te D- et al. Successful peripheral blood stem cell mobilization net' astш Patients with chronic myeloid leukemia achieving complete cytoge-tita resP°nse with imatinib, without increasing disease burden as measured by quan-ive real-time PCR // Leukemia, 2003. V. 17. P. 821-828.

55

  1. Zanjani E.D., Almeida-Porada G., Livingston A.G. et al. Human bone marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multilineage expansion that includes giving rise to CD34+cells // Exp. Hematol, 1998. V. 26. P. 353-360.

  2. BrittanM., Hunt T.JeffereyR. et al. Bone marrow derivation of pericryptal myofibroblasts in the mouse and human small intestine and colon // Gut., 2002. V. 50. P. 752—757

  3. DirekzeN.C, Forbes SJ., Brittan M. et al. Multiple organ engrafment by bone marrow derived myofibroblasts and fibroblasts in bone-marrow-transplanted mice // Stem Cells, 2003. V. 21. P. 514-520.

  4. Brazelton T.R., RossiF.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice // Science, 2000. V. 290 (5497). P. 1672—1674.

  5. WangX., GeSh., McVamara G, Hao Q.L., Crooks G.M., NotlaJA. Albumine-expressJJ ing hepatocyte-like cells develop in the livers of immune-deficient mice that received transplants of purified human hematopoietic stem cells // Blood, 2003. V 101 N10 P. 4201-4208.

  6. HerzogE.L.,ChaiL.,KrauseD.S. Plasticity of marrow-derived stem cells //Blood, 2003 V. 102. N10. P. 3483-3493.

  7. Balsam L.B., Wagers A J., Christensen J.L., Kofidis Т., Weissman I.L., Robbins R.C\ Haemopoietic stem cells adopt mature haemopoietic fates in ischemic myocardium//) Nature, 2004. V. 428 (6983). P. 668-669.

  8. Murry C.E., Soonpaa M.H., Reinecke #., Nakqjima HO., RubartM., PasumarthiK.B., Virag J.I., Bartelmez S.H., Poppa V., Bradford G., Dowell J.D., Williams D.A., Field L.J. Haemopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts // Nature, 2004. V. 428 (6983). P. 607-608.

  9. Bailey AS., Jiang S., Afentoulis M., Baumann C.I., Schroeder D.A., Olson S.B., Wong M.H., Fleming W.H. Transplanted adult hemopoietic stems cells differentiate into func­tional endothelial cells // Blood, 2004. V. 103 (1). P. 13-19.

  10. NorolF., MerletP., IsnardR., Sebillon P., BonnetN, Cailliot Ch., Carrion C, Ribeiro M., CharlotteF,PradeauP.,MayolJ.F.,PeinnequinA.,DrouetM.,SafsafiK., VernantJ.-P., Herodin F. Influence of mobilized stem cells on myocardial infarct repair in a nonhuman primate model // Blood, 2003. V. 102. N13. P. 4361^368.

  11. AscariA. et al. Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy // Lancet, 2003. V. 362. P. 697—703.

  12. Hill W.D. et al. SDF-1 (CXCL12) is upregulated in ischemic penumbra following stroke: association with bone marrow cell homing to injury // J. Neuropathol. Exp.' Neurol., 2004. V. 63. P. 84—96.

  13. Levescque J.P. et al. Disruption of the CXCR4/CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by GCSF or cyclophosphamide //J. Clin. Invest, 2003. V. 111. P. 187-196.

  14. Kawabata Y., Hiokawa M., Komatsuda A., Sawada K. Clinical applications of CD34+ cell-selected peripheral blood stem cells // Ther. Apher. Dial., 2003. V. 7(3). P. 298—304.

  15. SugiuraK.JnabaM., OgataH, YasumizuR.,InabaK, GoodRA.,Ikehara S.Weal germ agglutinin-positive cells in a stem cell-enriched fraction of mouse bone marrow have potent natural suppressor activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988. V. 85. P. 4824— 4833.

  16. Sugiura K, Ikehara S., Inaba M., Haraguchi S., Ogata H, Sardina E.E., Sugawara M., 1 Ohta Y., GoodRA. Enrichment of murine bone marrow natural suppressor activity in 1 the fraction of hematopoietic progenitors with interleukin 3 receptor-associated anti- 1 gen // Experimental Hematology, 1992. V. 20. N2. P. 256—263.

59 Young M.R.I., Wright MA., Lozano Y., Prechel M.M., Benefield J, Leonetti J, Colluns Sh.L., Petruzzelli G.J. Increased recurrence and metastasis in patients whose primary head and neck squamous cell carcinomas secreted granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and contained CD34+ natural suppressor cell//Int. J. Can­cer (Pred.Oncol), 1997. V. 74. P. 69-74.

50. Sugiura K, Pahwa S., Yamamoto Y., Borisov K., Pahwa R., Nelson R.P.Jr., Ishikawa J, Iguchu Т., OyaizuN., GoodRA., Ikehara S. Characterization of natural suppressor cells in human bone marrow // Stem Cells, 1998. V. 16. N2. P. 99-106.

  1. WrightMA., WiersK., Vellody K., D/ordjevic D., Young M.R. Stimulation of immune suppressive CD34+ cells from normal bone marrow by Lewis lung carcinoma tu-mours//Cancer Immunol.Immunother., 1998. V. 46. N5. P. 253—260.

  2. WiersK., WriightMA., Vellody K., Young M.R. Failure of tumor-reactive lymph node cells to kill tumor in the presence of immune-suppressive CD34+ cells can be over come with vitamin D3 treatment to diminish CD34+ cell level//Clin Exp.Metastasis, 1998. V. 16. N3. P. 275-282.

  3. WiersK.M., Lathers D.M., WrightMA., Young M.R. Vitamin D3reatment to diminish the levels of immune suppressive CD34+ cells increases the effectiveness of adoptive immunotherapy // J. Immunother, 2000. V. 23. N1. P. 115-124.

  4. Рысулы M.P., Беляев H.H., Шалбаева АД., Искалиева С.С., Богданов А.Ю. Гемо-поэтические стволовые клетки. Под ред. М. А. Алиева. Алматы: Мектеп, 2005. 133 с.

  5. Беляев Н.Н. Натуральная супрессия как иммунологическая функция гемопоэти-ческих стволовых клеток//Научные приоритеты казахстанской аллергологии и иммунологии. Алматы: Раритет, 2005. С. 74—88.

  6. Беляев Н.Н., Закирьянова Г.К., Беклемишев А.Б. Антимитогенный фактор костного мозга и его регуляция гистамином // Иммунология, 1991. №3. С. 27—29.

  7. Закирьянова Т.К., Беляев Н.Н. Изопикническое разделение клеток костного мозга// Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии, Алматы, 1999. С. 142-145.

  8. Belyaev N, Zakiryanova G, Atikova Т., Sinenko S., Bernikov S. Modulating effect of histamine in bone marrow//XXIV Annual Meeting of European Histamine Research Society. Moscow, May 20—25 1995. Moscow, 1995. P. 9.

  9. Belyaev N.N., Zakiryanova G.K., BeklemishevA.B. Histamine-induced contrasuppression in bone marrow/Дп Vitro Cellular & Developmental Biology/World Congress on Cell and Tissue Culture, 20-25 June 1992, Washington, 1992. V. 28. N3. Part II. P. 169a.

  10. Беляев Н.Н., Закирьянова Т.К., ХегайЛА., Беклемишев А.Б. Анализ антимитогенной и гистаминсвязывающей активности изопикнических фракций клеток костного мозга // Иммунология, 1993. №3. С. 15—17.

  11. Берников СВ., Закирьянова Т.К., Беляев Н.Н. Обогащение суспензии клеток костно­го мозга гистаминсвязывающей фракцией // Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии. Алматы, 1999. С. 146—150.

  12. Bernikov S., Belyaev N., Zakiryanova G. Suppressive and histamine induced contrasuppressive activity of bone marrow cells separated by percoll and affinity sorbent // XXYI Annual Meeting of European Histamine Research Society, Seville. Spain, 14—17 May, 1997. P. 321-322.

  13. Беляев Н.Н, Закирьянова Г.К. Феномен гистамин-опосредованной контрсупрес­сии (ГОКС) в костном мозге. Экспериментальный и теоретический анализ // Известия HAH PK, 1995. № 3. С. 34-39.

57

  1. Богданов А.Ю., Саввулиди Ф.Г., Тлеулиева Р.Т., Беляев НЛ. Альфа-фетопротеин I как индуктор натуральных супрессорных (NS) клеток костного мозга. I. Изопик- I нические фракции NS-клеток и их супрессорные эффекты // Биотехнология. I Теория и практика, 2004. № 3. С. 83—89.

  2. Богданов А.Ю., Беляев ЕЛ. Альфа-фетопротеин как индуктор натуральных суп- 1 рессорных (NS) клеток костного мозга. П. Молекулярная природа супрессорных 1 факторов // Биотехнология. Теория и практика, 2004. № 3. С. 90—98.

  3. Алиев М.А., Беляев НЛ.,АбзалиевК.Б., СериковЛ. С, Богданов А. Ю., Саввулиди Ф.Г., I Тлеулиева Р.Т. Иммунологическая оценка эффективности применения рон- I колейкина в кардиохирургии при лечении инфекционного эндокардита // Цито- I кины и воспаление, 2004. Т.З. № 1. С. 28—31.

%. А. Сатыбалдиева, Б. А. Жумабаева (РШ "Национальный центр

экспертизы лекарственных средств МЗ РК"),

Р. С. Кузденбаева (КазНМУ),

М. Рысулы (ТОО "Стэмкорд")

ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И УРОВНЯ

ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ЛИЦ

ПРИ ВВЕДЕНИИ ПРЕПАРАТА СУСПЕНЗИИ (ВЗВЕСИ)

ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ПУПОВИННОЙ КРОВИ

Одной из главных задач настоящего исследования является изучение влияния препарата Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток пуповинно-плацентарной крови на основные показатели иммунной системы и цитокиновый профиль условно здоровых лиц в динамике.

В организме начало иммунного ответа отнюдь не совпадает с моментом антигенного раздражения различного происхождения. Основные механизмы иммунитета включаются вскоре после антигенного стимула, а реакции клеточ­ного иммунитета развиваются не ранее 15 дней. Кроме того, по данным литера­туры (С. И. Моисеев, К. М. Абдулкадыров, СПб, 2004 г.) приживление стволо­вых клеток наблюдается на 16—50 сутки, в среднем на 30 день. Последнее обстоя­тельство послужило причиной определения сроков исследования показателей иммунитета (количественного содержания основных иммунокомпетентных клеток и их субпопуляций) и цитокинового профиля через 15,30 и 45 дней с момента введения препарата Суспензии (взвеси) ГСК плацентарно-пупо-винной крови.

Изучение цитокинов различных видов интересовало нас с точки зрения реактивности иммунной системы и процессов иммунорегуляции у здоровых лиц в процессе трансплантации ГСК пуповинной крови.

Уровень цитокинов в сыворотке крови наряду с количественным содержа­нием иммунокомпетентных клеток может служить признаком реагирования иммунной системы на введение ГСК, маркером реакций острой фазы и воспа­ления как первой линии защиты, а также проявлением общей реактивности организма.

Оценка показателей иммунной системы условно здоровых лиц при введении препарата Суспензии (взвеси) ГСК пуповинной крови в динамике.

Изучение показателей иммунной системы осуществлялась нами путем Фенотипирования основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови с Помощью метода проточной цитометрии с использованием различных Сборов моноклональных антител, меченных такими флюорохромами, как Флюоресцеинизотиоцианат (FITC), фикоэритрин (РЕ), перидинин-хлорофилл Протеин (Per CP) (производства фирмы «Becton & Dickinson», США).

Метод проточной цитофлуориметрии сформировался за последние 30 лет "а основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их

59

размеров. Методом проточной цитофлуориметрии можно исследовать пролиферативную активность нормальных и опухолевых клеток на основе анализа клеточного цикла, проводить иммунофенотипирование клето^ периферической, пуповинной крови, костного мозга [1].

Проточная цитофлуориметрия представляет собой исследование в прохо­дящем свете лазера клеток, находящихся в потоке жидкости, поэтому основным требованием к анализируемому образцу является его состояние в виде суспеЛ зии клеток. Объектами для исследования методом проточной цитофлуори­метрии (ПЦ) могут быть кровь, костный мозг, различные пунктаты и биоптаты. В основе метода лежит способность поверхностных клеточных рецепторов (CD антигенов) связываться со специфическими антителами, мечеными различными флуорохромами. При прохождении окрашенной таким образом клетки через пучок лазера происходит возбуждение флуоресцирующих красителей. При этом может происходить одновременное возбуждение разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Световой сигнал усиливается на фотоумножителях проточного цитометра и обеспечивает информацией о размере клетки, гранулярности, а также об экрИ прессии тех или иных антигенов, что позволяет определить принадлежность щ той или иной субпопуляции. В качестве источника света в проточном цитофлуориметре используется аргоновый лазер с длиной волны возбуждения 488 нм, регистрация флюоресценции осуществляется при 517 нм для флуореЯ сцеинизотиоционата FITC, при 600 нм и более для фикоэритрина РЕ и пери-динин-хлорофилл протеина РегСР/фикоэритрина-цианина 5 РЕ-Су5 каналов флюоресценции на первом (FL1), втором (FL2) и третьем (FL3) фотоумножи­телях соответственно. Первый (FL1) — это детектор, выявляющий красители зеленого цвета (FITC), второй (FL2) —детектор определяет красители красного спектра (РЕ), третий (FL3) — для красителя перидининхлорофилла РегСГЯ Таким образом получают данные по прямому (forward side scatter (FSC)) под углом 0,50—2° и боковому (side scatter (SSC)) под углом 90° светорассеянию, а! также по флюоресценции клеток, связавших флюорохром-конъюгированные антитела. Прямое светорассеяние дает информацию о размере клетки; боковое светорассеяние несет информацию о структуре клетки, о соотношении I размеров ядра и цитоплазмы; интенсивность флуоресценции позволяет | выявить плотность того или иного антигена на поверхности клетки [2].

Стандартная пробоподготовка для выявления поверхностных маркеров клея ток осуществляется по протоколу окрашивание—лизис—отмывка и окрашива-1 ние—лизис—без отмывки [3,21].

Протокол пробоподготовки без отмывки включает в себя следующие этапы: I

— добавление 20 мкл меченных соответствующим флюорохромомЯ
моноклональных антител 100 мкл исследуемого образца крови;

—инкубация в течение 15—30 мин при комнатной температуре в затемненномИ месте;

— добавление лизирующего раствора, содержащего диэтиленгликоль НЩ
формальдегид для лизирования эритроцитов с последующей инкубацией в 1
течение 10 мин. После всех вышеназванных этапов сбор данных возможен.

При необходимости отсрочить анализ на 2—24 ч, пробоподготовка можетя

йыть дополнена фиксацией клеток образца добавлением фиксирующего яствора, содержащего формальдегид. Протокол пробоподготовки с отмывкой включает в себя следующие этапы:

— добавление 20 мкл меченных соответствующим флюорохромом
моноклональных антител в исследуемый образец крови;

—инкубация в течение 15—30 мин при комнатной температуре в затемненном

месте;

— добавление лизирующего раствора, содержащего диэтиленгликоль и

формальдегид для лизирования эритроцитов с последующей инкубацией в течение 10 мин;

—центрифугирование в течение 5 мин при 300 х g оборотах в мин;

—удаление супернатанта и повторное центрифугирование в течение 5 мин при 200 х g оборотах в мин, с фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% натрия азид;

— удаление супернатанта и добавление фиксирующего раствора,
содержащего формальдегид.

После соответствующей пробоподготовки определяли процентное содержание тех или иных популяций клеток на проточном цитофлуориметре (FACS Calibur, «Becton & Dickinson», США).

Метод ПЦ обладает целым рядом преимуществ:

—возможность исследования в ходе одного анализа большого числа клеток (более 100 000, тогда как микроскопия позволяет исследовать только несколько сотен клеток) за короткое время исследования (минуты);

—возможность измерения интенсивности флуоресценции, позволяющей выявить плотность того или иного антигена на поверхности клетки;

Определение популяционного состава клеток крови.

С развитием метода проточной цитофлуориметрии определение иммунофе-нотипа клеток крови человека уже не представляет особой сложности и позволяет оценивать экспрессию нескольких CD (Clusters of differentiation) маркеров одновременно. Для этого используют способность клеток связываться со специфическими антителами. В настоящее время уже извест­но около 250 таких CD-молекул.

Следует отметить, что последнее полуторадесятилетие в иммунобиологии ознаменовалось идентификацией целой системы дифференцировочных антигенов-кластеров на поверхности иммунных и неиммунных клеток, которые классифицируются согласно виду экспрессирующих их клеток и молекуляр­ной массе. На этой основе с помощью моноклональных антител (AT) опре­деляются CD-антигены (CD-АГ Claster differentiation antigen).

До 1989 г. было известно только 7 CD-AT. В1989 г. Номенклатурный Коми­тет ВОЗ провел IV конференцию по лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека и добавил 35 новых кластеров и субкластеров [1,2]. V Международное рабочее совещание (1993, Бостон, США) значительно

дополнило список и в настоящее время известно уже около 200 различных CD-антигенов.

CD-молекулы представляют собой поверхностные мембранные гликопро-теины (реже протеины), продуцируемые клеткой в клеточносвязанной (CD) и в растворимой (sCD) формах. Как и у всех рецепторов клеток, у CD молекулы различают три части: экстрацеллюлярную, трансмембранную и интрацц-топлазматическую.

Среди CD-клеточных мембранных протеинов различают, согласно Biologi­cal Abstracts, определенную группу РЕЦЕПТОРОВ, например, CD 21 — рецептор комплемента CRII, CD 23—рецептор к Ig E, CD 25 — рецептор для IL-2, CD 35—рецептор комплемента CRI, CD lib/CD 18-дляСЯ III, CD 54-ICAM-1, CD 64 — то же для IgG. Для связывания с ними на нелимфоидньгх клетках экспрессированы CD-молекулы—ЛИГАНДЫ. Следует заметить, что по своей природе все молекулы CD являются антигенами.

Взаимодействие антигенов CD на иммунокомпетентных клетках-лимфо­цитах с их специфическими лигандами на распознаваемой клетке-контрагенте приводит к активации, дифференциации и эффекторной фазе лимфоцита или другой клетки.

Номенклатура CD- АГ быстро увеличивается за счет вновь открываемых, расширяется благодаря идентификации субкластеров (обозначаемых а, Ь, с и т. д.) [4].

Все CD-антигены являются либо трансмембранными белками, либо белками, заякоренными на мембране через гликозилфосфатидилинозит. Исследование структуры большого числа CD-антигенов показало, что щш можно подразделить на группы, имеющие участки с заметной гомологией в аминокислотной последовательности и, как следствие, с одинаковой пространственной упаковкой.

Примером может служить суперсемейство иммуноглобулинов. для которых характерно наличие в структуре внеклеточной части молекул Ig-подобных доменов. Эти домены могут быть подобны вариабельным (V), константным (С) доменам иммуноглобулинов или же иметь смешанный тип (V-C). Описано более 100 белков, принадлежащих к суперсемейству иммуноглобулинов, среди них CD-2 (LFA-2), CD-58 (LFA-3), CD-54 (ICAM-1), ICAM-2, VCAM-1, рецептор Т-клеток CD-3, CD-4, CD-8, HLA класса IЩ HLA класса II [4].

Семейство интегринов—адгезивные гетеродимеры, образованные общей бета-цепью (CD 18) и одной из трех различных альфа-цепей (CD 1 la, CD 1 lb, CD lie). Интегрин CD 1 la/CD 18 известен как функциональный лимфо-цитарный антиген 1 типа (LFA-1), CD lib/CD 18 называют также CR 3, а CD llc/CD 18—CR 4 (он известен и как p. 150,95). Кроме вышеперечисленных, относятся: CD 29 (VLA-1 - VLA-6), CD41, CD 49a /CD 29 (VLA-4/LPAM-l),| CD49b,CD49c,CD49d(LPAM-2),CD51,CD61,CD 103, CD 104.

Селектины (от select и lectin) — семейство из трех структурно-родствен-1 ных мембранных гликопротеинов. Включают три типа молекул: лейкоцитар­ные L - (CD 62 L, LECAM-1, Mel 14) представлены на лимфоцитах, моноцитах, 1 нейтрофилах и опосредуют миграцию в периферические лимфоузлы (для I

62

лйМфоцитов) и зону воспаления (моноциты, нейтрофилы). Эндотелиальные g„ (ELAM-1, CD 62E) - селектины экспрессированы на активированных эндо-телиальных клетках. Тромбоцитарные селектины Р (CD 62 Р, PADGEM — протеин, GMP-140) экспрессируются васкулярными эндотелиальными клетками и тромбоцитами. При стимуляции этих клеток различными факторами, такими как тромбин, гистамин, ионофоры кальция и т. д., селектин быстро (в минуты) перемещается к поверхности клетки, где опосредует взаимодействие с клетками и отвечает, в частности, за ранние события в рекрутировании лейкоцитов в очаг воспаления.

ТМ4 — семейство мембранных протеинов, пронизывающих плазмати­ческую мембрану четыре раза. Относятся CD 53, CD 9, CD 37, CD 62, CD 82,

CD 81).

TNF/GNF (туморонекротический фактор—фактор роста нервной ткани) — суперсемейство, основанное на общности строения обогащенных цистеином повторностей экстрацеллюлярного региона рецептора. Относятся CD 27, CD 30, CD 40 и CD 95. Экспрессируются на лимфоидно-гематопоэтических клетках. Включены в индукцию секреции цитокинов, регуляцию адгезивных молекул, активацию антигенов и костимуляцию протеинов [4,5].

Все CD-молекулы выявляют с помощью меченых моноклональных антител. В качестве метки в ПЦ используются различные флюорохромы.

Анализ фенотипа клеток, как правило, проводится в два этапа [6]. На первом этапе изучаемые клетки оцениваются и выделяются по параметрам светорассеяния (FSC и SSC). Затем выделяются регионы в зависимости от флуоресцентной метки.

На рисунках представлены двухмерные гистограммы клеток пуповинной крови, меченых антителами CD 34.

На рис. 1 представлена характеристика размера и гранулярности клеток пуповинной крови. По оси абсцисс—FSC, по оси ординат—SSC. Выделенная красным цветом область R 1 характерна для лимфоцитов, имеющих низкий уровень гранулярности (SSC), область R 2 — мононуклеарные

клетки, область R 3 — грану- 8j—^" . .,..:.,„—..—,.»-■—■■■-..

лоциты, которые имеют наибо- -1: /-: /.

лее высокий уровень SSC(rpa- 8- / /

нулярности). °° : ■ ./ ■■■'; '■-. '\-;Л "У'-У-г-.' ' У

Стволовые клетки CD 34+ о' •" ■'•].-: '%&'~%Хъ-> /
занимают промежуточное по- Т10" ■. />".**§! /

ложение между лимфоцитами и $0: '■'/.ЙЙиШ^ /
моноцитами и характеризуются §~ '--Ч— '' /

как лимфоидные клетки круп- йдИ $7^

ного размера, практически не §'- jjfljj J^yv .
имеющие включений [7], поэто- SrV

му область выделения по пара- о -, ,^Щ^?Щг1у, , . , , ,

Метрам светорассеяния FSC и о гоо 400 боо 800 юоо

SSC включает в себя как FSC"H

лимфоциты, так и моноциты Рис. 1

63

Dala.030 0 Data.030

о J Т*-" ' • ■ -—-.-—•.-- -1 о-I | ■—i

о ■ ■ ■; ,;.:'.:.\;-. ,':.j//' ■'' ' о '

I r.|^iig:; Г_

0 200 400 6Ю 800 1000 10° 101 102 103 104

FSC-H FL2-H

Рис. 2 Рис. З

(рис. 2). На рис. 3 стволовые клетки CD 34+ локализованы в нижнем правом квадрате (положительный сигнал по F1 2) и имеют низкие уровни гра­нулярности (SSC), т. е. эти клетки практически не содержат клеточных включений.

Таким образом, развитие метода проточной цитометрии позволило изу­чать с высокой точностью такие малые популяции клеток, как например, стволовые клетки.

Оценка уровня основных субпопуляций клеток иммунной системы на фоне введения препарата ГСК здоровым лицам.

Забор крови для иммунологических исследований производили натощак из локтевой вены одноразовой иглой в специальную вакуумную систему (ваку-тейнер), содержащую 6% ЭДТА. После чего вакутейнер с кровью осторожно переворачивается несколько раз для перемешивания крови с антикоагулянтом.

Проводилось определение количественного содержания следующих попу­ляций иммунокомпетентных клеток:

—определение содержания Т-супрессоров, несущих маркер CD 8+; —определение содержания NK-клеток, экспрессирующих CD 16+ маркеры, обладающие противоопухолевой и противовирусной цитотоксичностью;

— определение активированных мононуклеарных клеток (МНК) CD 25+,
несущих рецептор к ИЛ-2;

—определение уровня гемопоэтических стволовых клеток, несущих маркер CD34+.

Все обследуемые были поделены на три группы:

  1. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 2,5—2,9 х 105/кг;

  2. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 3,4—3,8 х 105/кг;

  3. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 4,2—4,8 х 105/кг.

64

Диаграмма 1

Содержание CD 3+ у добровольцев

89,5

70 шл 8),е V \

% 40 ■ 1 группа

30 D2 группа

20 ■ D3 группа

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

Оценка иммунного статуса проводилась до введения препарата, на 15,30 и 45 сутки после введения препарата.

Результаты оценки иммунного статуса.

Как видно из диаграмм 1, отмечалось достоверное повышение уровня Т-лимфоцитов с фенотипом CD 3+ во всех трех группах на 15-е сутки после введения препарата. К 45 дню после введения препарата уровень этих клеток вернулся к исходному.

Содержание Т-хелперов (CD4+) (диаграмма 2) достоверно повышался к 15

Диаграмма 2

Содержание CD4+ у добровольцев

60 Л~ gg — - -

' 5° Јfl ^А 43

Ж Щ

% 30■' в1 группа

20 I «2 группа

Ю I а3фуппа

о MiiiiiiiipkJJLJ I И ИмИ 1г

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования (дни)

65

р

Диаграмма 3

Содержание CD 8+

44

407 35д=л

t г :8,i № кл

25 fl :8':;

%20 ,1 i1 группа

15- I 02 группа

10 ■' d3 группа

01 шшт\\ш\ 1 Lin 1 fl ■iLLiJ •

До 15сут. ЗОсут. 45сут. Сроки исследования (дни)

дню во всех исследуемых группах, но наиболее высоким был в третьей группе, что свидетельствует о дозозависимости результата.

Содержание Т-супрессоров (CD8+) к 15 дню повышалось во всех трех груп­пах и к 45 дню после введения вернулось к норме (диаграмма 3).

Отмечалось незначительное повышение уровня NK-клеток во всех трех группах на 15 сутки (диаграмма 4).

Наиболее существенное влияние препарат оказал на изменение уровня ГСК (CD 34+) (диаграмма 5). Отмечалось увеличение уровня ГСК (CD 34+) в 4,8 раза в первой группе, в 5,2 раза во второй группе и в 4,5 раза в третьей группе на 15 сутки. К 30 дню уровень ГСК достиг максимального в 3 группе (1,1%). Через 45 дней с момента введения препарата уровень ГСК в первой

Диаграмма 4

Содержание CD 16+ у добровольцев

. TJTT"

До 15сут. ЗОсут. 45сут.

Сроки исследования

I 66

Диаграмма 5

Содержание CD 34+ у добровольцев

1,2 /V 1,1

0 8 I ilfl

% 0,6 ■ 1 группа I

0,4' °^^,ЗД°.33 ■ 2 группа

До 15сут. ЗОсут. 45сут.

Сроки исследования

группе снизился вдвое, в 2,8 раза во второй группе и в 3,3 раза в третьей группе обследуемых по сравнению с показателями, отмеченными на 30-е сутки. Необходимо отметить, что содержание CD34+ клеток и через 45 дней с момента введения Суспензии ГСК пуповинной крови было выше исходного уровня.

Значительно изменилось содержание клеток — активированных моно-нуклеаров, несущих рецептор для интерлейкина -2 CD25+ во всех группах после введения препарата ГСК пуповинной крови (диаграмма 6).

Уровень CD 25+ в первой группе к 15-му дню после введения препарата Достоверно повысился в 4,8 раза в первой, в 5,3 раза—во второй и в 3,8 раза— в третьей группах соответственно. К 30-му дню после введения препарата

Диаграмма 6

Содержание CD 25+ у добровольцев

1-2[ 1,06

До 15сут. ЗОсут. 45 сут.

Сроки исследования

67

уровень CD 25+ достиг максимального уровня во второй группе (1,06%) й вернулся к исходному через 45 дней наблюдения.

Таким образом, введение препарата Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови оказало выраженное стимулирующее влияние на основные показатели иммунной системы у обследованных лиц всех трех групп. Необходимо отметить резкое увеличение содержания CD 34+ клеток (ГСК) уже через 15 дней после введения во всех трех группах обследованных лиц, которое сохранялось в течение всего срока исследования. Наиболее показательные данные были в третьей группе, что говорит о высокой дозозависимости результатов. Повысилось содержание активированных МНК CD 25+, несущих рецептор к ИЛ-2, эти данные коррелируют с данными, полученными при изучении уровня ИЛ-2 у этих же добровольцев (г = 0,90). Уровень ИЛ-2 достоверно повышался к 30-му дню во второй и третьей группах.

Изучение цитокинового профиля условно здоровых лиц при введении ГСК пуповинной крови.

Цитокины—это белковые или полипептидные продукты активированных иммунокомпетентных клеток, основная роль которых заключается в осуществлении межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, гемопоэзе и развитии воспаления. Необходимо отметить, что они служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма и разделяются на несколько групп: интерлейкины (ИЛ) — факторы взаимо­действия между лейкоцитами; интерфероны (цитокины с противовирусной и противоопухолевой активностью); факторы некроза опухолей (цитокины с цитотоксической активностью); колониестимулирующие факторы (гемопоэти-ческие факторы). Разделение это весьма условно.

Условно здоровые лица-добровольцы, которым вводили препарат Суспен­зия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, были разделены на три группы:

  1. группа (4 человека) — введен препарат в дозе от 2,4—2,9 х 105/ кг массы;

  2. группа (9 человек)—доза 3,4—3,9 х 105/ кг массы;

  3. группа (7 человек)—доза 4,4—4,9 х 105/ кг массы. Нами исследованы следующие цитокины:




• Колониестимулирующие факторы (G-CSF), (GM-CSF).
Содержание цитокинов определяли щл помощи твердофазного иммуно-Я

ферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем производства ЗАО "Вектор-Бест" (г. Новосибирск, Россия) - ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-6, у-ИФН, . а-ФНО, а также фирмы "Citolabs" (Израиль) - ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-15,ИЛ-17, LIF, G-CSF, GM-CSF.

68

Концентрация цитокинов исчислялась в пг/мл.

Провоспалительные цитокины обеспечивают первую линию защиты и вырабатываются большим числом различных клеток организма. Естествен­ными индукторами выработки этих цитокинов является действие микробов или их токсинов. Все они усиливают синтез белков острой фазы. Провоспали­тельные цитокины обладают исключительной широтой действия и много­численными мишенями. В комплексе эти эффекты способны обеспечить раз­витие воспаления и воспроизвести все его локальные и общие симптомы [8,9].

ИЛ-1 обладает многогранным действием: мобилизует неспецифические факторы защиты и систему иммунитета, вызывает метаболические изменения. Основные биологические эффекты ИЛ-1 можно разделить на иммуноло­гические, воспалительные, кроветворные и межсистемные. ИЛ-1 причастен к запуску начальных этапов иммунного ответа, в частности к вовлечению Т-хелперов.

Под влиянием трансплантации ГСК пуповинной крови уровень ИЛ-1 у лиц 1-й группы возрастал через 15 дней с момента введения, увеличивался через 30 дней и становился даже ниже исходного уровня через 45 дней (диаграмма 7).

Аналогичная закономерность отмечалась у лиц 2-й и 3-й групп. Можно отметить ярко выраженную дозозависимость. Так, у добровольцев 3-й группы уровень ИЛ-1 был достоверно выше, чем в 1-й и 2-й группах.

Уровень ИЛ-6 изменялся несколько иначе (диаграмма 8). Так, выраженной дозозависимости не отмечалось. Содержание ИЛ-6 у лиц 2-й и 3-й групп практически было одинаковым, и различия по срокам исследования были не достоверными. Вместе с тем через 30 дней после введения у лиц 3-й группы отмечалось значительное повышение содержания ИЛ-6 и снижение его уровня через 45 дней до уровня 1-й и 2-й групп.

Диаграмма 7

Уровень ИЛ-1 у добровольцев до и после введения препарата СК

35 ТТ" 30,8

зо-' — Г

25 ' 20,9 П[

20 ' Г\ г -,

ic у la? В^ группа

До 15сут. ЗОсут. 45 сут.

Сроки исследования

69

Диаграмма 8

Уровень ИЛ-6 у добровольцев до и после введения препарата СК

20

15 15

15 jS9 em SJ 11-5

2 группа !
5 | а 3 группа


До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

Поскольку продуцентами ИЛ-6 являются такие клетки, как фибробласты, гепатоциты, моноциты и макрофаги, а индукторами являются прежде всего бактериальные продукты, то полученные результаты можно рассматривать как закономерные, т. е. введение ГСК не вызвало выраженной индукции ИЛ-6 во всех группах (за исключением 3-й группы через 30 дней с момента введения ГСК).

Уровень а-ФНО (фактор некроза опухолей-альфа) также имел выражен-

|ную дозозависимость (диаграмма 9). Так, увеличивалось содержание а-ФНО у лиц 3-й группы через 15 и 30 дней после введения ГСК. Содержание а-ФНО

Диаграмма 9

Уровень ФНО у добровольцев до и после введения препарата СК

1>63

1,5 Г

1,(25
0,92 0,9 ft,.. пяат 0,87

1 шш=я о.7! i °й| в 1 группа]

и,зШ °Јш РТУ 1 ■ 2 группа

ОШ пЗ группа

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

в 1-й и 2-й группах после введения практически не изменялось, а через 45 дней

было ниже исходного.

Активационные цитокины: ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-4, ИЛ-17.

Наиболее важный активационный ИЛ-2 (диаграмма 10) стимулирует пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов, повьппает цитолитическую активность NK-клеток, является хемоаттрактантом для эозинофилов [10,11], способствует развитию лимфокинактивированных клеток-киллеров, пролиферации В-лимфоцитов и секреции иммуноглобулинов.

Как видно из данных, представленных на рис. 4, уровень ИЛ-2 во всех группах обследованных лиц отмечалась общая закономерность: выраженная дозозависимость, значительное увеличение ИЛ-2 через 15 суток, еще больший подъем через 30 дней исследования и снижение — через 45 дней с момента введения ГСК. Причем содержание ИЛ-2 в 1-й и 2-й группах к концу исследования приближалось к исходным величинам.

ИЛ-15 имеет сходную с ИЛ-2 биологическую активность, стимулируя пролиферацию Т-лимфоцитов. Анализ содержания ИЛ-15 (диаграмма 11) на фоне введения ГСК пуповинной крови показал, что в целом динамика изменений содержания его сходна с данными по ИЛ-2, за исключением более высоких показателей в первый срок исследования.

Интерлейкин-4продуцируется Т-лимфоцитами, макрофагами, тучными клетками, базофилами, стромальными клетками костного мозга. Основной функцией ИЛ-4 является индукция дифференцировки Т-лимфоцитов в Т х 2-клетки (Т-хелперы 2 типа) [ 12], стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов, способствуя продукции IgE, активизирует макрофаги и гранулоциты [13]. I Содержание ИЛ-4 у лиц 1-й и 2-й групп через 15 дней после введения препарата ГСК пуповинной крови практически не отличалось от исходных данных I (диаграмма 12). В третьей группе в этот же срок наблюдалось значительное

Диаграмма 10

Уровень ИЛ-2 на фоне введения препарата СК пуповинной крови

5 4,12

4/ m

I3 2,17 1 ФУппа

2-^ 1,12 19| 1 (| ■ 2 группа

._, 0,83^' |о,38 083<М5 1

1 Ш f=M I 0,р^ D3rpynna

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

Диаграмма Я

Уровень ИЛ-15 на фоне введения препарата СКпуповинной крови

0,77 1

' 0,65
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


Учебный материал
© bib.convdocs.org
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации