Алиев. Современные клеточные технологии в медицине - файл n1.doc

Алиев. Современные клеточные технологии в медицине
скачать (1468 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc1468kb.21.10.2012 09:57скачать

n1.doc

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

0,7 ^ 0,58

ПЙ I ,<=■ °'51 °'53

°-5 2^ И °Ј °,зЛ

0,4 I (щЫ @ 1 ФУППI

0,3 ■ 2 rpynnd

0|2 I D3rpynna

q УИИИЯКДЬ-^ИюдД ПИЯ Р
До 15 сут. ЗОсут. 45сут.


Сроки исследования

Диаграмма Щ

Уровень ИЛ-4 у добровольцев

2,5 А"

2,13

2

0 95 Ш 1 гРУппг1

ДО 15 сут. ЗОсут. 45 сут.

Сроки исследования

72

Диаграмма 13

Уровень ИЛ-17 у добровольцев

0,9" ГТ \

0,8

06 °'55 0,5

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

повышение уровня ИЛ-4, которое сохранялось на довольно высоком уровне через 30 дней и к 45-му дню наблюдения достигало до исходных величин.

ИЛ-17, который также можно отнести к активационным интерлейкинам, вырабатывается CD-4+ лимфоцитами [14,15]. ИЛ-17 является стимулятором гранулоцитопоэза, усиливает образование G-CSF. У 1-й группы обследованных уровень ИЛ-17 изменялся следующим образом (рис. 13): через 15 дней после введения ГСК содержание ИЛ-17 незначительно снижалось, затем через 30 дней увеличивалось до 0,51 пг/л, после чего через 45 дней наблюдения понижалось до исходного уровня. Во 2-й группе отмечалось увеличение

Диаграмма 14

Уровень ИЛ-10

1,4

1,2 1,08

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

73

содержания ИЛ-17 к 30-му дню и снижение ниже исходных величин через 451 дней наблюдения. Уровень ИЛ-17 у лиц, составляющих 3-ю группу, был резко! повышен через 30 и 45 дней исследования, в 2 раза превышая исходный уровень.!

Супрессорный ИЛ-10 является важнейшим регулятором иммунного ответа,! подавляющим активность макрофагов и Тх-1-клеток и способствует реали-1 зации биологических эффектов Тх-2 (диаграмма 14). Кроме того, ИЛ-10 cno-J собен затормозить синтез провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО, ИФ-т| [11]. Вместе с тем ИЛ-10 повышает пролиферацию В-лимфоцитов и секрецию иммуноглобулинов. Изучение уровня содержания ИЛ-10 показало несколько иную картину, чем динамика изменений содержания других цитокинов. Так, и 1-й группе через 15 дней отмечалось резкое понижение его величины, затем через 30 дней концентрация ИЛ-10 увеличивалась, не доходя до исходного щ через 45 дней снова понижалась. Аналогичная динамика отмечалась во 2-я группе, однако показатели ИЛ-10 были более высокими. В 3-й группе уровени ИЛ-10 почти в 2 раза возрастал по сравнению с исходным через 15 и 30 днем наблюдения и резко снижался через 45 дней. Следует отметить, что содержания ИЛ-10 во всех группах к концу исследования резко снижалось.

Чрезвычайно важными биологическими эффектами обладает ИЛ-Я (диаграмма 15), который стимулирует хемотаксис нейтрофилов, субпопуля! ций Т-лимфоцитов и базофилов, а также повышает сродство нейтрофилов Л моноцитов к эндотелиальным клеткам, тем самым способствуя развитии! реакции острой фазы. Выброс хемокина на 30-е сутки наблюдения, особенно щ лиц 2-й и 3-й групп, является признаком развития острых реакций на ГСК. I

Следует отметить, что через 45 дней ИЛ-8 у лиц 1-й и 2-й групп полностью отсутствовал, в то время как в 3-й группе этот цитокин оставался на довольна высоком уровне.

Диаграмма 15л

Уровень ИЛ-8 у добровольцев

U

* yjJ5—- ^^| - UfeMb—

0,4 0,23 □ 3 групгкЯ

j^^^^^^^^^^JH ИДИ пмщ^н ^^F

До 15сут. ЗОсут. 45сут.

Сроки исследования

74

Активаторы В-лимфоцитов:

ИЛ-12 служит посредником между макрофагами и лимфоцитами, ^рожденным и приобретенным иммунитетом, что проявляется в способности регулировать соотношение между клеточным и гуморальным иммунитетом через стимуляцию дифференцировки Т-хелперов в Т х 1, (стимулирует активность NK-клеток, обусловливает дифференцировку цитотоксических лимфоцитов). ИЛ-12 способствует активации В-клеток (особенно В 1-клеток), следовательно, повышает уровень аутоантител.

ИЛ-12 обусловливает выход стволовых кроветворных клеток в перифери­ческую циркулирующую кровь и формирование экстрамедуллярных очагов кроветворения (диаграмма 16).

ИЛ-13 — фактор роста В-лимфоцитов, влияет на функцию моноцитов и В-лимфоцитов, повышает антигенпредставляющую активность клеток (диаграмма 17). Кроме того, он индуцирует синтез IgE В-лимфоцитами [ 19].

Уровень ИЛ-13 также отличается выраженной дозозависимостью. Так, содержание его у лиц 3-й группы резко увеличивается уже через 15 дней после введения ГСК пуповинной крови и постепенно снижается через 30 и 45 дней наблюдения, в то время, как в 1-й и 2-й группах уровень ИЛ-13 снижается ниже исходных величин.

Уровень лейкоз-ингибирующего фактора (LIF, диаграмма 18) определялся с учетом данных о том, что он подавляет дифференцировку плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток, способствует пролиферации гемопоэти-ческих клеток-предшественников, а также стимулирует продукции остро­фазных белков.

В этом исследовании также отмечается высокая дозозависимость содер-

Диаграмма 16

Уровень ИЛ-12 у добровольцев

W 1

1,5 JIM

1 о,б °Щ °'т 0,6Э я1 группа

0,5 Ш 1 III Л^2 12 группа

До 15 сут. ЗОсут. 45 сут. Визиты добровольцев

75

Диаграмма /?

Уровень ИЛ-13 у добровольцев

MfT ~T22~"

1 0,83

I wi uSI' „Л "Н

0,4 Оо^ г1! °g a 2 группа

°'о iImiiiiipiiiiiI И В 1 КДД In D 3 гРУппа

До 15 сут. ЗОсут. 45сут.

Визиты добровольцев

жания LIF в сыворотке крови (диаграмма 18) . Наибольшие показатели отмечаются в 3-й группе исследуемых лиц через 30 суток с момента введения ГСК пуповинной крови.

Колониестимулирующие факторы (КСФ), или гемопоэтины, включаютв себя G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) и GM-CSF

Диаграмма IS

Уровень LIF у добровольцев

1гТ~ 0,88

0,8

0,6 0.47

04 L S1 fЈ! °43 И1фУППа|

n JL I 1 Ц 1 I U D3групп!

До 15 сут. ЗОсут. 45 сут. Визиты добровольцев

I

(гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). Они образуются клетками стромы костного мозга и других органов, макрофагами, активированными Т-лимфоцитами. Индукторами синтеза КСФ могут быть бактериальные продукты, полиэлектролиты, антигены. Под влиянием G-CSF увеличивается продукция в нейтрофилах нейтрофильного аттрактанта, что способствует мобилизации нейтрофилов в участки воспаления [ 16].

Динамика содержания G-CSF в сыворотке крови у добровольцев была следующей (диаграмма 19). Через 15 дней с момента введения ГСК у лиц 1-й группы уровень G-CSF практически не изменился. Через 30 дней содержание G-CSF увеличилось и вернулось к исходному уровню через 45 дней наблюдения.

У лиц 2-й группы отмечалось незначительное повышение уровня G-CSF через 15 и 30 дней и оставалось несколько сниженным (не доходя до исходного) через 45 дней с момента введения ГСК.

В 3-й группе уже через 15 дней наблюдалось значительное увеличение содержания в сыворотке крови G-CSF, которое резко возрастало к 30-му дню и снизилось к исходному уровню через 45 дней.

Аналогичная динамика изменений в испытуемых группах наблюдалась и в значениях GM-CSF как по срокам наблюдения, так и в группах добровольцев (диаграмма 20).

Выраженная дозозависимость показателей КСФ и крайне высокая степень увеличения содержания этих показателей через 30 дней с момента введения ГСК отражает процессы инициации гранулицито / миело / моноцитопоэза в естественных условиях.

Интерферон-гамма (Y-ИФН) вырабатывается активированными Т-лим-фоцитами и NK-клетками, важнейшей его функцией является участие в опо­средовании взаимосвязей между лимфоцитами и макрофагами и в регуляции клеточного и гуморального иммунитета. Он активирует нейтрофилы и НК клет­ки, стимулирует антителопродукцию к полисахаридным антигенам [ 17,18].

Диаграмма 19

Уровень GCSF у добровольцев

0,8; р

0,7

0,6

0,5 0,43

а л '■ / Г*н1 н 1 ФУппа

4 0JS 0-325

-WjrtJ ■■■■■» -"ДМ из— . f~, Q ггч\ /n n n

0,3 0,225 0,22 0jfe= И^ 0,25, р.2,5 □ 2 группа

До 15 сут. ЗОсут. 45 сут.

Сроки исследования

77

Диаграмма 20

Уровень GMCSF у добровольцев

0,6 0,53

0,5

па °j37

nt n->k ПГ 0.275 0,27 .

0,3 о,2 Д c,3:t Я_Г1 ■ 1 группа j

0,1 'В'2' ПЗ группа

До 15сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

Диаграмма 211

Уровень гамма интерферона у добровольцев

8

7 6,3

6 Г

J-; 2>65 2,69 2,975^ 2о25 295 ^па I

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки введения

8 динамике содержания у-ИФН в сыворотке крови у добровольцев
(диаграмма 21) прослеживаются те же закономерности, что и при изучении
других цитокинов, т. е. происходит увеличение содержания через 15 дней
исследования, после чего к 30-му дню показатели содержания -^ИФН достигают»
наибольших величин во всех группах, и к 45-му дню наблюдения показатели
уровня у-ИФН снижались до исходного.

* * *

Таким образом, изучение уровня цитокинов в сыворотке крови при введении ГСК пуповинной крови показало, что во всех группах исследуемых отмечалосЛ

I

Увеличение их содержания по сравнению с исходными показателями (до введения ГСК) за исключением провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-яяьфа) в 1-й и 2-й группах обследованных лиц. Эта закономерность характерна дяя всех видов цитокинов во всех группах обследованных лиц. Причем через 30 ^ей с момента введения ГСК пуповинной крови увеличение уровня цитокинов було наиболее выраженным.

Можно отметить высокую дозозависимость содержания цитокинов в исследуемых группах. Так, у лиц, составляющих 3-ю группу, увеличение уровня цитокинов значительно превышало таковые показатели в 1-й и 2-й группах. Особенно ярко это проявляется в содержании колониестиму-дирующих факторов. Инициация выброса гемопоэтинов (КСФ) в результате введения ГСК по принципу положительной обратной связи, в свою очередь, должна приводить к стимуляции выброса ГСК из костного мозга в периферическую кровь, что и было отмечено по результатам изучения содержания CD 34+ (стволовых) клеток в периферической крови обследо­ванных лиц в те же сроки.

Это говорит о выраженной активации системы цитокинов под влиянием введения ГСК, степень которой пропорциональна величине исследуемой дозы.

Поскольку клетки иммунной системы имеют соответствующие рецепторы к цитокинам, то увеличение их при введении ГСК неизменно должно приводить к стимуляции иммунного ответа, что и показано в соответствующем разделе настоящего отчета.

Выявленные сдвиги цитокинового профиля у обследованных лиц могут считаться весьма благоприятным эффектом биологического действия ГСК пуповинной крови, вполне безопасным и, учитывая широту и многоплановость биологических действий цитокинов, взаимную индукцию, взаимосвязи, а также участие их в процессах иммунорегуляции, нетрудно представить их роль в опосредовании и нормализации нарушенных иммунологических реакций в целостном организме.

При анализе индивидуальных данных цитокинового профиля нами было установлено, что при исходно сниженных показателях содержания цитокинов, отмечался более выраженный выброс практически всех цитокинов, в особенности КСФ (гемопоэтинов) через 30 дней с момента введения ГСК пуповинной крови. Это подтверждается также увеличением содержания CD 34+ (стволовых) клеток. К сожалению, в рамках настоящего исследования нам не представилась возможность более детального и углубленного изучения показателей иммунитета и цитокинового профиля в зависимости от исходных Данных. Однако мы усматриваем в усилении реакции иммунитета при исходно низких показателях приспособительную реакцию организма, что является общей закономерностью при введении биологически активных веществ Различного происхождения.

Описанные выше закономерности изменений цитокинового профиля соотносятся с результатами изучения количественного содержания основных йммунокомпетентных клеток организма исследуемых лиц, которое опреде­лялось методом проточной цитофлуориметрии.

I Введение препарата Суспензии ГСК пуповинной крови показало 79

выраженное стимулирующее влияние на основные показатели иммунной системы у обследованных лиц всех трех групп. При этом также можно отметить высокую дозозависимость полученных показателей. Повысилось содержание активированных МНК CD 25+, несущих рецептор к ИЛ-2, эти данные коррелируют с данными, полученными при изучении уровня ИЛ-2 у этих асе добровольцев (г = 0,90). Уровень ИЛ-2 достоверно повышался к 30-му дню вД второй и третьей группах.

Цитокиновая система не может быть инициирована без мощного антигенного стимула, каковым является препарат Суспензия (взвесь) ГСК пуповинной крови, в свою очередь под их влиянием активизируются клетки иммунной системы, которые начинают усиливать продукцию цитокинов. Тая осуществляются общебиологические принципы положительной обратном связи как основы автоматического регулирования и дублирования систем, которые направлены на сохранение гомеостаза организма.

ВЫВОДЫ:

1. Введение препарата Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых
клеток вызвало выраженную стимуляцию основных показателей иммунной
системы у всех обследованных лиц. Наиболее значительная стимуляция
отмечалась по содержанию популяции клеток, несущих CD 34+ маркеры.

  1. Содержание активированных МНК CD 25+ клеток, несущих рецептор к ИЛ-2, увеличивалось, причем отмечается высокая корреляция с данными, полученными при изучении уровня ИЛ-2 у этих же добровольцев (г = 0,90). I

  2. При изучении цитокинового профиля обследованных, условно здоровых лиц, было выявлено, что введение препарата Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток стимулировало их продукцию уже через 15 дней после введения препарата. Наибольших величин уровень цитокинов достигал через 30 дней наблюдения и снижался до уровня нормальных величие! к 45-му дню исследования.

  3. Выявлена высокая дозозависимость практически по всем исследуемым параметрам цитокинового профиля и показателям иммунитета. Стимуляция основных исследуемых параметров была прямо пропорциональна величине вводимой дозы.

  4. Выявлена взаимная индукция цитокинов и основных иммунокомпе-тентных клеток по принципу положительной обратной связи, что особенна выраженно прослеживается по содержанию гемопоэтинов (G-CSF и GM-CSF) и количественного содержания CD 34+ (стволовых) клеток.

  5. Препарат Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) плацентарно-пуповинной крови в исследуемых дозах (2,4—2,9 х 105/ кг массы, 3,4—3,9 х 105/ кг массы, а также 4,4—4,9 х 105/ кг массы является безопасным и эффективным стимулятором иммунной системы.

  6. Наиболее выраженным иммуностимулирующим действием обладает доза препарата 4,4-4,9 х 105 / кг массы при общей безопасности для организма условно здоровых лиц.

80

Литература

\ Козинец Г.И., Погорелое В.М., Шмаров ДА., Боев С.Ф., Сазонов В.В. // Клетки крови — современные технологии их анализа. М.: Триада-Фарм, 2002.

2. BauerK.D., Duque R.E, Shankey T. V. Clinical flow cytometry. Principles and applica­tion. Baltimor, 1993. 635 p.

3 GratamaJ. W., SutherlandD.R., KeeneyM., Papa S. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents, 2001. Vol. 15. P. 14-22.

  1. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона и Дж. Магки. М.: Мир, 1999. 506 с.

  2. Беклемишев Н.Д., Сатыбалдиева Ж.А., Суходоева Г.С. Поверхностные дифференцировочные антигены клеток иммунной системы // Известия МОН РК, HAH PK. Серия биологическая и медицинская. 2000. № 5. С. 69—74.

  3. РойтА., БростоффДж., МейлД. // Иммунология. М.: Мир, 2000.

  4. Шмар ов Д.А., Козинец Г.И. // Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови.

  5. А ндрееваЛ.Ю., Тупицын Н.Н. // Субпопуляция периферических стволовых гемопо­этических клеток (ПСГК). Проточно-цитофлюориметрическая идентификация ПСГК на основании светорассеяния, экспрессии CD 34, CD 45, AC 133* // Вопро­сы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2002. Т. 1. С. 60—65.

  6. Bosh X., Miranda F., Filella X. et al. An inflammatory, but not an anti-inflammatory, cytokine profile is present in patients with unstable angina and correlates with progno­sis // Europ.Heart J. 1999. Vol. 20 (Abstr. Suppl). P. 522.

  7. CusakM., MarberM.S., Odemujiwa S. et al. Does miocardial necrosis contribute to the inflammatory response in unstable angina? // Europ.Heart J. 2000. Vol. 21 (Abstr. Suppl.). P. 245.

  8. Суворова К.Н. И РМЖ. 1998. Т. 6. С. 363-367.

  9. Карпова В.А., Свечникова Н.Н., Коненков В.И. // Роль аллельного полиморфизма генов цитокинов в развитии атопического дерматита. Сб. "Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты". 2004.

  10. Reinhold V. et al. // Acta Dermatol. Venerol. 1989. Vol. 69. P. 497-502.

  11. Bohml, Bauer R. // Hautarzt. 1997. Vol. 48. P. 223-227.

  12. FossiezF.,QossouO., ChomaratP. et al. //J. Experimental. Med. 1996. Vol. 183.P 2593-2603.

  13. Yao Z., Painter S.L., Fanslow W.C., Ulrich D. et al. // J. Immunol. 1995. Vol. 155 . P. 5483-5486.

  14. SuzukiS., KobayashiM., ChibaK. et al. // Blood. 2002. Vol. 99. № 5. P. 1863-1865.

  15. Randow F, Docke W.D., Bundschuh D.S. et al. // J. Immunology. 1997. Vol. 158. P. 2911-2918.

!9. Schinkel C, LichtK, ZedlerS. et al. // J. Trauma. 2001. Vol. 50. P. 321-327.

  1. Collins D.P. Related Articles Cytokine and cytokine receptor expression as a biological indicator of immune activation: important consideration in the development of in vitro model systems// Immunol J.Methods. 2000. Vol. 243 (1—2). P. 125—145.

  2. Mumepee Г.Ю. Номенклатура антигенов CD (кластеров дифференцировки лейкоцитов) // Гематология и трансфузиология. 1994. Т. 39. № 6. С. 45—48.

  3. ПинегжБ.В.,ЯрилжА.А., Симонова А.В. и др. Применение проточной цитометрии Для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие Для врачей-лаборантов. М.:ФГУП«Медсервис» при Минздраве России. 2001. 53 с.

81

L

С. М. Мамадалиев, Е. Н. Троицкий, Б. М. Хайруллин, Н. Т. Битов, 1 А. К. Наханов, К. Д. Сембаев (Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности НЦБ МОН РК)

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Клеточная трансплантация как наиболее физиологический вариант заместительной терапии получает все большее распространение в современной медицинской практике. Этот метод рассматривается как возможный дополнительный либо самостоятельный способ коррекции функциональной несостоятельности некоторых органов и тканей. Многие исследователи расценивают в перспективе имплантацию культур клеток как метод, I определенной степени альтернативный органной трансплантации. В этом плане заметный прогресс достигнут в области пересадок (алло- и ксенотрансплан-тация) островковых клеток поджелудочной железы инсулинозависимым больным сахарным диабетом [ 1— 3].

Сегодня во всем мире ведутся эксперименты по созданию клеток, сокра­щающих омертвевшую после инфаркта сердечную мышцу, заживляющих ожоги на большой площади тела, наращивающих кость, а также восстанавли­вающих кроветворную функцию костного мозга у больных лейкемией. Стало известно, что стволовые клетки (СК), происходящие из эмбриональных источников и организма взрослых, имеют большой терапевтический потенциал для применения в клинической практике (клеточная терапия). СК, выделенные из костного мозга и моноцитов периферической крови человека, применяются при лечении аутоиммунных заболеваний, ревматизма, рассеянного склероза, системной красной волчанки. В Европе исследования по применению гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для лечения аутоиммунных заболеваний находятся на III стадии клинических испытаний [4,5].

Широкие возможности применения стволовых клеток для клеточной заместительной и восстановительной терапии были положительно оценены в США, Японии, Китае, Корее, Израиле и ряде других стран. В США, несмотря на существующий до последнего времени запрет на государственную поддержку работ согласно инструкции Национального института здоровья (NIH USA) по выделению СК из эмбриона человека, работа с линиями таких клеток разрешена частным лабораториям и биотехнологическим компаниям, включая разработку методов получения линий клеток человека и терапевти­ческого их использования. Однако их применение в клинической практике наталкивается на негативное восприятие общества с позиций морально-этических и религиозных ценностей. Не решена и проблема их канцерогенной и генетической безопасности.

Использование эмбрионов, абортированных по медицинским показаниям или отбракованных в процессе искусственного оплодотворения (ЭКО) дЯ*1

82

научных и практических целей также запрещено во многих странах. Оно запрещено из этических соображений, поскольку даже в пробирке эмбрион «же может считаться будущим живым организмом.

В связи с поисками новых путей решения проблемы заместительной терапии с использованием стволовых клеток внимание биологов и клиницистов привлекла способность ГСК давать начало различным типам специализи­рованных соматических клеток под влиянием ряда индуцирующих ростовых факторов и сохранять эту способность после длительной криоконсервации. ГСК, полученные из костного мозга, уже давно применяются для лечения онкологических заболеваний [6]. По своим свойствам ГСК относятся к плюрипотентным стволовым клеткам, способным дифференцироваться в любую линию клеток крови и иммунной системы. Их можно в различных количествах получить также из периферической и пуповинной крови [4,5,7]. Пока все проводимые исследования с применением СК носят предваритель­ный экспериментальный характер и их результаты не разрешены для клинического применения. По данным FDA (американской ассоциации по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами) широкое использование СК в клинической практике можно ожидать не ранее чем через 5 лет. Однако все-таки существуют разрешительные документы для исполь­зования определенного типа СК (гемопоэтических, кроветворного происхож­дения) в гематологии. Это единственный легальный метод, который существует уже тридцать лет и используется при лечении лейкемии и ряда других заболеваний. Трансплантация ГСК является разрешенным методом в рамках доказательной медицины, всей методологии, существующей на данном уровне нашего понимания медицины.

Основанием для проведения научно-исследовательских работ в разработке технологии выделения и культивирования ГСК человека с последующей дифференциацией в кардиомиоциты являются такие документы, как Стратегия развития Республики "Казахстан-2030", Стратегия индустриально-инно­вационного развития страны на 2003—2015 гг., Послание Президента Республики Казахстан от 18 февраля 2005 г. и Государственная программа реформирования и развития здравоохранения на 2005—2010 гг., где в качестве первоочередных задач была указана разработка новых технологий, современных методик лечения и медицинского обслуживания. Также основанием для выполнения Данного направления НИР являются результаты тендера Министерства обра­зования и науки РК на разработку научно-исследовательских проектов в 2006 г. и Постановление Правительства Республики Казахстан № 307 от 14 марта 2006 г. по Республиканской научно-технической программе "Разработка современных технологий для создания кластера по биотехнологии в Республике Казахстан на 2006-2008 гг.".

Необходимость таких исследований обусловлена тем, что сердечная не­достаточность является одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран. Для лечения сердечной недостаточности в Настоящее время используют широкий спектр лекарственных препаратов и Немедикаментозных методов, таких как коронарное шунтирование, кардио-^оюпластика, искусственное сердце, трансплантация сердца, ультрафильтра-

83

ция и др. Между тем частота развития и распространенность ее в человеческой популяции нарастает, именно поэтому существует необходимость в разработке принципиально новых, доступных и эффективных методов коррекции сердечно^ недостаточности. В этом плане разработка метода культивирования ГСК с последующей дифференциацией в кардиомиоцитоподобные клетки даст большой сдвиг в отечественной науке и в клеточно-заместительной терапии при лечении заболеваний сердечно-сосудистой патологии.

Анализ научной и патентной литературы показывает, что исследование взрослых стволовых клеток уже показало большие перспективы в лечении многих болезней, связанных с дегенерацией ткани — инфарктов, инсультов болезней Паркинсона и Альцгеймера, сахарного диабета [8—10]. Результаты экспериментов на животных показали, что взрослые СК могут восстанавливать поврежденные ткани сердца, оказывать положительное действие после инсуль­тов и устранять диабет. Уже сейчас взрослые стволовые клетки успешно при­меняют в лечении системной красной волчанки, рассеянного склероза, артрита и многих других заболеваний человека. Поэтому с научной точки зрения про­должение работ с эмбриональными стволовыми клетками не является жизнен­ной необходимостью, не говоря уже о моральных и этических вопросах [8].

Методы получения клеток и их применение в медицине разработаны или разрабатываются в различных исследовательских учреждениях ряда государств, включая Россию. В Республике Казахстан аналогичные работы до настоящего времени не проводились, и разработка методов получения и применения кардиомиоцитов из ГСК человека является весьма актуальной задачей, имеющей не только научную, но и практическую значимость.

Выбор направления исследований

В современном мире биотехнологическая отрасль исследований СК является одной из наиболее приоритетных и наукоемких областей человеческой деятельности. Авторитетный в научном сообществе журнал "Science", подводя итоги развития биологической науки в XX в., на третье место после открытия двойной спирали ДНК и расшифровки генома человека поставил открытие в человеческом организме клеток-предшественников, т. е. СК. Эти клетки способны при определенных условиях превращаться в нервные, костные, мышечные и кровяные клетки. Идея регенеративной терапии с использованием своих или чужих СК, а также использование специфических факторов роста, которые стимулируют выход СК в периферический кровоток, на сегодняшний день уже стала реальностью.

Анализ современных тенденций и факторов развития биотехнологии СКй развития клеточных технологий в лечении ряда серьезных заболеваний человека свидетельствует о том, что ведущие страны мира прилагают значительные усилия, чтобы эта область исследований развивалась опережающими темпами. В 2004 г. объем капитальных вложений в разработку клеточных технологий вырос более чем в 5 раз по сравнению с 1998 г. Созданы и создаются крупнейшие научно-исследовательские центры как в развиты* западных странах, так и в азиатском регионе (Корея, Сингапур, Япония). 1

При этом большое внимание уделяется клеточным технологиям) основанным на трансплантации СК, полученных от самого больного

84

Преимущества этих технологий заключаются в доступности подходящего нейМмуногенного клеточного материала (приемлемый источник — костный м0зг). Получены экспериментальные данные, указывающие на перспектив­ность применения аутологичных костно-мозговых стволовых клеток, которые пя счет морфогенетической функции своих лимфоцитов, а также ГСК способны обеспечить регуляцию восстановительных процессов в органах различного фенотипа, а также в лечении тяжелых неврологических и сердечно-сосудистых расстройств [9—13].

Одно из главных препятствий широкому применению в клинике взрослых стволовых клеток—проблемы с их размножением вне организма. Дело в том, что истинных плюрипотентных СК во взрослых тканях крайне мало, а когда их удается выделить и перевести в лабораторную культуру, они быстро начинают дифференцироваться в специализированные клетки той ткани, из которой были получены. При этом утрачивается одно из самых ценных их свойств — возможность превращаться в клетки других типов. Поэтому размножить взрослые стволовые клетки без потери ими "стволовости" до сих пор было почти невозможно.

Ученые из Whitehead Institute [14] открыли способ увеличить число взрослых стволовых клеток без изменения их качеств в 30 раз — это в 10 раз больше, чем удавалось кому бы то ни было до сих пор.

Изучая ГСК фетальных тканей мыши, ученые обнаружили популяцию клеток, которые сами не были стволовыми, но взаимодействовали с ними, позволяя им делиться и сохранять их "стволовость". При совместном культивировании этих новооткрытых клеток со стволовыми последние хорошо размножались в культуре.

Чтобы выяснить, благодаря каким белкам происходит это взаимодействие, был исследован профиль генетической экспрессии этих клеток и обнаружены гены, активные только в них. Один из них кодирует фактор роста IGF-2. Этот белок был выделен и при добавлении в культуральную среду и давал возможность увеличить численность ГСК в 8 раз. Затем были открыты еще два фактора роста, названные angptl-2 и angptl-З (сокращение от Angiopoietin-Uke 2 и 3). Использование при культивировании ГСК всех трех новых факторов роста и позволило увеличить их число в 30 раз [ 14].

Если удастся повторить эти результаты на человеческих ГСК, откроется множество новых возможностей—как для исследовательских работ, так и для клеточной терапии. Например, если будет можно размножать ГСК, гораздо более широкое применение найдут трансплантации СК пуповинной крови. В Данный момент ограничение связано с тем, что СК в одном образце пуповинной кРови недостаточно для взрослого реципиента, а использование крови от нескольких доноров значительно увеличивает риск отторжения.

Для генной терапии многих врожденных заболеваний у пациента берут СК,

Методами генной инженерии блокируют работу мутантного гена и вводят в

"Их нормальный ген. Затем эти клетки возвращают пациенту, но бывают

ДУчаи, когда из-за неправильной работы вектора переноса активируются

Нкогены и начинается канцерогенез. Если такие генно-инженерные СК могли

bI быть размножены в лаборатории, можно было бы провести отбор на

85

отсутствие нежелательных изменений и только после этого вводить пациенД Исследования в этом направлении продолжаются в сотрудничестве со шведским Lund University с целью повторить эти эксперименты с ГСК пуповинной крови человека[14].

Переход этот обусловлен в первую очередь тем, что в отличие от медика­ментозного и хирургического методов лечения, при которых пытаются сохра­нить то, что еще пока не уничтожено инфарктом, при трансплантации СК возможно создание новых устойчивых ростков нормально функционирующее здоровой ткани в миокарде. В результате этого и наблюдаются более положи­тельные результаты, по сравнению с классическими способами лечения [151,

Сегодня клеточной кардиомиопластикой при сердечно-сосудистых заболеваниях занимаются в ведущих клиниках Европы, Азии, США и России (Москва, Владивосток, Иркутск, Томск, Новосибирск и др. крупные города), Накоплены неопровержимые доказательства безопасности и эффективности этого метода. В Казахстане в настоящее время эта область исследования практически не развита.

Учитывая вышеизложенное, разработка методов получения и применения кардиомиоцитов из ГСК человека для лечения больных методом трансплан­тации является крайне актуальной задачей, имеющей научно-практическое значение.

Для достижения поставленной цели нами были использованы современные методы клеточной биотехнологии. В соответствии с организационно-методическим планом работ по проекту в задачу наших исследований входило:

1. Разработка оптимальных методов получения первичного материала, содержащего гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) человека из различных источников (костный мозг, пуповинная и периферическая кровь).

2 Определение условий краткосрочного хранения и транспортирования первичного материала, содержащего ГСК.

  1. Разработка методов выделения ГСК человека из различных источников.

  1. Разработка и совершенствование методов культивирования ГСК человека ex vivo.

Выполнение исследований по данной проблеме обеспечит разработку технологии получения и культивирования кардиомиоцитов из ГСК человека с последующим применением в клеточно-заместительной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Общая характеристика и источники гемопоэтических стволовых клеток.

Гемопоэтические стволовые клетки — предшественники клеток, циркулирующих в крови, которые способны многократно делиться й дифференцироваться в различные популяции лейкоцитов, эритроцитов И тромбоцитов. ГСК образуют все разнообразие клеток крови, определяющих иммунитет, борющихся с инфекциями, переносящих кислород и участвующих в процессах свертывания крови. ГСК характеризуются мультипотентностьЮ и дают начало клеточным линиям, конечные элементы которых образуют форменные элементы крови, а также ряд специализированных тканевых клеток иммунной системы. Потенциал образования клеточной массы у ГСК огромен СК костного мозга ежедневно продуцируют 10" клеток, составляющих фор'

86

нцые элементы периферической крови. Как и все стволовые клеточные ^ сурсы, ГСК присутствуют в костном мозге в весьма незначительных коли­чествах, что обусловливает определенные трудности при их выделении [4,16]. Иммунофенотипически ГСК человека характеризуются как CD 34+ озитивные клетки, способные мигрировать в кровеносное русло и заселять 0ганы иммунной системы или репопулировать строму костного мозга. ГСК е являются наиболее незрелыми клетками костного мозга, а происходят от редшественников, к которым относят фибробластоподобные негативные клетки. Установлено, что клетки с фенотипом CD 34-негативные способны к вьгходу в общий кровоток, где меняют свой фенотип на CD 34+ позитивные, но при обратной миграции в костный мозг под влиянием микроокружения вновь становятся CD34" негативными клеточными элементами. В состоянии покоя CD 34' негативные клетки не реагируют на паракринные регуляторные сигналы стромы (факторы роста, цитокины). Однако в ситуациях, требующих усиления интенсивности кроветворения, СК с фенотипом CD 34" негативные отвечают на дифференцированные сигналы образованием как гемопоэтических, так и мезенхимальных клеток-предшественников [4].

ГСК считаются наиболее изученным источником СК, что во многом связано с их использованием в клинике при трансплантации костного мозга. Присутствие в костном мозге клеток с фенотипом CD 34~, являющихся родоначальниками как мезенхимальных, так и гемопоэтических СК, поставило вопрос о существовании наиболее ранних, приближенных к CD 34~ негативным клеткам предшественников клеточной дифференцировки в стромальную и гемопоэтическую линии.

Для функциональной характеристики выделенных ГСК используют их способность создавать колонии зрелых форменных элементов крови в культуре. Анализ сформированных колоний позволяет идентифицировать и количественно оценить типы клеток-предшественников, степень их коммитирования, а также установить направление их дифференцировки. Клоногенная активность определяется в полутвердых средах на метилцел-люлозе, агаре, плазменном или фибриновом геле, снижающих миграционную активность клеток, что предотвращает их прикрепление к поверхности стекла или пластика. В оптимальных условиях культивирования клоны из одиночной клетки развиваются за 7—14 дней. Учитывается количество клеток, способных образовать колонию (колониеобразующие единицы—КОЕ или колониеобра-3Ующие клетки — КОК). Следует заметить, что параметры КОЕ и КОК не соответствуют количеству ГСК в клеточной суспензии, хотя некоторые авторы Щ коррелируют с ним, что еще раз подчеркивает необходимость определения Функциональной активности ГСК in vitro.

Поиск возможностей более качественного выделения ГСК продолжается. иДнако стволовые кроветворные клетки морфологически подобны лимфоци­там и представляют собой относительно однородную совокупность клеток с почти круглыми ядрами, мелкодисперсным хроматином и небольшим Количеством слабо базофильной цитоплазмы. Точное их количество цРеделить тоже сложно. Допускается, что ГСК в костном мозге человека СтРечаются с частотой 1 на 106 ядросодержащих клеток.

87

Для улучшения качества идентификации ГСК проводится последова­тельное или одновременное исследование спектра мембранносвязанны* антигенов, причем ГСК с фенотипом CD 34+CD 38~ клетки должны сочетаться с отсутствием маркеров линейной дифференцировки, особенно антигенов иммунокомпетентных клеток, таких как CD 4 [19].

Более перспективным для идентификации ГСК следует признать CD 133 антигенный маркер клеток-предшественников гемопоэза, экспрессия которого впервые выявлена на клетках эмбриональной печени. CD 133—трансмембран-ный гликопротеид, который появляется на поверхности клеточной мембраны на самых ранних этапах созревания ГСК, не исключено, что даже раньше чем антиген CD 34 [19].

Петренко А. и Грищенко В. [18] отмечают существенные отличия иммунологических свойств и способности к восстановлению кроветворения ГСК разного происхождения, что обусловлено неодинаковым соотношением содержащихся в их источниках ранних полипотентных и поздних коммитиро-ванных клеток-предшественников. Кроме того, ГСК, полученным из различных источников СК, присущи количественно и качественно совершенно иные ассоциации не гемопоэтических клеток.

Традиционным и более изученным источником ГСК является костный мозг. Суспензию клеток костного мозга получают из подвздошной кости или грудины методом вымывания под местной анестезией. Полученная таким образом суспензия гетерогенна и содержит смесь ГСК, стромальных клеточных элементов, коммитированных клеток-предшественников миелоид-ной и лимфоидной линий, а также зрелые форменные элементы крови. Количество клеток с фенотипом CD 34+ среди мононуклеаров костного мозга составляет от 0,5 до 3,6%. В периферической крови после индуцированной мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF) ГСК содержится от 0,4 до 1,6%. В пуповинной крови содержание клеток с иммунофенотипом CD 34+ составляет около 0,6% [4].

Трансплантированные ГСК способны восстанавливать систему кроветво­рения при ее поражении вследствие болезни или химиотерапии основного заболевания.

Первые исследования по экспериментальной трансплантации костного мозга почти 50 лет назад начинались с анализа выживаемости животных при тотальном их облучении с последующей инфузией кроветворных клеток костного мозга.

Ученые сумели доказать особые свойства костного мозга человека. Ока­залось, что в нем содержится в 10 раз больше СК, чем в любом другом органе и пересадку костного мозга уже давно применяют для лечения иммуноде-фицитов и злокачественных заболеваний крови. Этому свидетельствуют существующие в настоящее время медицинские банки данных, где собраны сведения о потенциальных донорах костного мозга.

Качество трансплантата зависит не только от количества содержащихся в нем CD 34+ клеток, но и от их функциональной активности, которую можно оценить только по уровню пролиферативной активности путем оценки колониеобразования in vivo и in vitro [19]. Максимальное количество CD 34+

88

леток (24,6%) обнаружено в трансплантационном материале, полученном з фетального костного мозга. Костный мозг взрослого человека содержит л i% CD 34+ позитивных клеточных элементов. При этом колониеобразую-пая способность CD 34+ клеток фетального костного мозга в 2,7 раза превы­шает возможности колониального роста костно-мозговых гемопоэтических кЛеток взрослого человека, а клетки пуповинной крови формируют значительно больше колоний, чем кроветворные элементы, выделенные из ерИферической крови взрослых людей, — 65,5 и 40,8 колоний 105 клеток, соответственно.

Следующим ценным источником ГСК, перспективным по пролифератив-ному потенциалу и репопуляционным возможностям кроветворных клеток, является пуповинная кровь. Неоднократно было показано, что к моменту родов пуповинная кровь содержит достаточно большое количество слабо коммитированных клеток-предшественников гемопоэза [20,21].

Особенностью ГСК является экспрессия на их поверхности антигена CD 34. Клетки с иммунофенотипом CD 34+ обладают высокой пролиферативной и клоногенной активностью, поэтому антиген CD 34+ считается широко распространенным маркером стволовых клеток. Определение количества CD 34+ клеток в пуповинной крови является ее важным показателем. Стволовые клетки относятся к ядросодержащим клеткам, поэтому важной характеристи­кой пуповинной крови является количество ядросодержащих клеток, которое в настоящий момент является стандартной оценкой трансплантата из пуповинной крови [22— 25].

Широкому внедрению в практику ГСК пуповинной крови способствовали не только простота и доступность получаемого исходного материала, но и другие важные свойства СК такие, как реконструкция гемопоэза, восстанов­ление клеточного и гуморального иммунитета, реакции трансплантата против клеток опухоли реципиента. Эти свойства делают ГСК пуповинной крови незаменимым при лечении онкогемотологических заболеваний и болезни крови любого генеза.

Использование пуповинной крови в качестве источника ГСК для трансплантации получило значительное распространение в последние десять лет, особенно в практике лечения педиатрических пациентов. В настоящее время в мире проведено более 5000 трансплантаций пуповинной крови [26,27], из них 6 трансплантаций проведено в России [28].

Пуповинная кровь как источник ГСК обладает рядом преимуществ, среди которых:

•быстрая и безболезненная процедура сбора;

•возможность получения и длительного хранения аутологичных, родственных и неродственных аллогенных образцов, тестированных и HLA-типированных, непосредственно готовых к использованию;

• сниженная вероятность развития острой и хронической формы реакции
трансплантат против хозяина;

•возможность проведения трансплантаций с неполной HLA-совмести-мостью;

• сниженная вероятность вирусной контаминации трансплантата;

89

• возможность получения образцов от представителей редких этнических меньшинств и детей от смешанных браков.

Повышение частоты использования пуповинной крови в качестве источника ГСК привело к необходимости создания специальных хранилищ — банков пуповинной крови, в которых образцы сохраняют в течение длительного времени без потери трансплантационного потенциала [24].

Все это обусловливает необходимость развития эффективных методов 1 получения и хранения ГСК из указанных источников, а также отработки методов забора образцов, сепарации, культивирования и криоконсервации ГСК до и после культивирования в полусинтетических питательных средах.

Методы получения первичного материала, содержащего гемопоэтические стволовые клетки.

Учитывая малые объемы крови, которые можно собрать из плаценты J (в среднем не более 100 мл), на передний план выступает необходимость получения максимального количества крови из вены, а также снижения риска | бактериальной контаминации образцов пуповинной крови (ПК).

Сбор пуповинной крови осуществляется после рождения ребенка и отде- 1 ления его от последа, когда плацента еще находится in utero или после ее рождения — ex utero, а также при кесаревом сечении (ex utero). Bertolini F.h 1 др. [29] установили, что если с момента рождения до отделения новорожденного от плаценты проходит не более 30 с, то собираемый объем крови в среднем на 25—40 мл больше, чем при более позднем отделении ребенка. Ими также отмечено, что раннее отделение ребенка от последа не влечет за собой каких- I либо отрицательных последствий для новорожденного. Эту точку зрения подтвердили и Lazzari L. и др. [30].

Для получения ПК предложены открытые и закрытые системы сбора.

Для снижения риска ятрогенного инфицирования и загрязнения материн- | скими выделениями Rubinstein Р. и др. [31] предложили использовать закрытую систему сбора, основанную на широко применяемой трансфузионной системе Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, USA, с 62,5 мл CPD A (citrate-phos-J phate-dextrose, with adenine) в качестве антикоагулянта. При этом жизнеспо- I собность клеток ПК не снижалась при хранении крови в течение 36 часов, даже если объем ее составлял 10 мл. Объем крови, собираемой таким способом, в среднем составлял 64 ± 27 мл. Собирать ПК можно и в тот момент, когда плацента еще находится in utero.

По данным Boyse E.A. и др. [32], количество крови, собираемой таким способом, в среднем составляло 55 ± 25 мл. Kogler G. и др. [33], собирая ПК закрытым способом (574 образца ПК), получили большие объемы крови в среднем 79 ± 26 мл. Ими отмечено, что около 7% образцов ПК содержало менее 40 мл крови, поэтому такие экземпляры ПК не включались в число 1 потенциальных трансплантатов. Abdel-Mageed C.E. и др. [34] путем катетеризации пуповинной вены удалось получить в среднем 94 мл крови (56—143 мл). Isoyama К. и др. [35], собирая ПК путем активной эксфузии при помощи шприцов, заготавливали в среднем 69,1 мл крови (объем ПК варьировалот15до135мл). NaglerA. идр. [36] сравнили три метода сбора ПК:

I


В первом случае они получили ПК в объеме 76,4 ± 32,1 мл с содержанием лейкоцитов 10,5 ± 3,6x106 мл; во втором — 174,4 ± 42,8 мл и 8,8 ± 3,4x106 мл лейкоцитов; в третьем — 173,7 ± 41,3 мл и 9,3 ± 3,8x106 мл лейкоцитов в крови. При использовании второго метода сбора было отмечено более частое инфицирование образцов ПК, чем при первом или третьем. Кроме этого, авторами установлена зависимость между массой плаценты и объемом извлекаемой крови, т. е. при большей массе плаценты количество собираемой ПК, как правило, возрастает.

Сбор ПК осуществляют после срочных родов естественным путем или кесарева сечения. В большинстве центров пуповинную кровь собирают после отхождения последа (ex utero), такой сбор может быть осуществлен вне родовой палаты специально обученным персоналом. Возможно проведение сбора ПК при нахождении плаценты в полости матки (in utero). Данный способ позволяет собрать больше лейкоцитов, но требует присутствия дополнительного персонала при родах. В основном для сбора предпочитают использовать закрытые стерильные контейнеры для донорской крови с внесенным антикоагулянтом и дренажной иглой [37]. Объем крови, которую получают из пуповины, в среднем составляет не более 100 мл [20].

Несколько лет назад СК получали только из костного мозга, который содержится в плоских костях. Для этого у донора под наркозом производили прокол кости таза и забирали шприцом необходимое количество костного мозга. После такой процедуры донор несколько дней в специализированном стационаре находился под наблюдением врача.

Необходимо заметить, что такой способ получения трансплантата практикуется и до сих пор и не имеет каких-либо серьезных осложнений. Тем не менее, в настоящее время появился более совершенный способ получения ГСК у донора—из периферической крови. При этом донор проводит несколько часов в кресле для взятия крови (смотрит телевизор или читает), кровь из вены на одной руке проходит через специальный прибор для сепарации нужных Для трансплантации ГСК и возвращается в кровяное русло донора через вену на другой руке. После такой процедуры донор практически не теряет объем крови, а восстановление взятых клеток происходит в течение первых же 7—10 Дней после процедуры. За исключением некоторых ситуаций донору, как правило, предоставляется возможность самому решать, каким способом он будет сдавать клетки крови.

Краткосрочное хранение и транспортировка первичного материала.

Доставка образцов пуповинной крови для ее обработки и длительного хРанения нередко осуществляется из регионов, удаленных от гематологических

91

центров. В этой связи возникает важный вопрос о возможных сроках хранения пуповинной крови до момента ее криоконсервирования, особенно при создании больших хранилищ, таких, как банки пуповинной крови [38— 41]. Юрасов С. в, и др. [42] показали, что при хранении ПК при комнатной температуре (22° С) или при 4° С в течение 24-^8 ч жизнеспособность клеток ПК принципиально не снижалась и составляла, соответственно, 92% и 88%. Однако при хранении образцов крови в течение трех суток отмечалось значительное снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток. Abdel-Mageed А. и др. [43] и Hubl W. и др. [44] в своих исследованиях показали, что при хранении в течение 2—3 суток при комнатной температуре или при 4° С прежде всего страдает жизнеспособность гранулоцитов, а не гемопоэтических клеток. Machalinski В. и др. [45] изучили влияние различных антикоагулянтов, которые связывают ионы кальция (ACD, EDTA, XAPD—1), на гемопоэтические предшественники при хранении ПК от 24 до 72 часов и выявили их отрицательное влияние на ЯСК. Machalinski В. и др. [45] рекомендовали использовать PBS (раствор фосфатного буфера) с добавлением нативного гепарина без консерванта в дозе 20 UED/мл. Такой антикоагулянт, по их мнению, позволял увеличить длительность хранения нефракционированной ПК до 72 ч, с удовлетвори­тельной сохранностью КОЕ (от 78 до 92%). Shlebak А. А. и др. [46], изучая сохранность КОЕ-ГМ и КОЕ-Г, показали, что время хранения пуповинной крови не должно превышать 9 ч.

Методы выделения гемопоэтических стволовых клеток человека из первичного материала.

Целью выделения ядерных клеток из пуповинной крови является уменьшение общего объема крови для дальнейшего замораживания клеток (экономия места) и удаление эритроцитов из-за опасности развития гемолитической реакции при трансфузии клеточной взвеси, несовместимой по эритроцитарным антигенам (А, В, 0, резус и др.).

Удаление эритроцитов можно проводить с помощью лизирующих растворов, содержащих хлорид аммония. Сохранность ГСК после лизиса эритроцитов достаточно высока, однако данный способ не применяют при банкировании в связи с необходимостью использовать очень большие объемш реагентов. Этот метод оправдан при обработке небольших объемов крови для лабораторных и диагностических исследований [47].

Для удаления эритроцитов и плазмы образец можно фракционировать методом простого центрифугирования (эффективно при обработке непосредственно после получения) или с помощью градиентов плотности [48].

Наибольшее распространение получил метод выделения ядросодержащих клеток в градиенте плотности фиколла. Сепарация в градиенте плотности позволяет получить преимущественно мононуклеарные клетки, но приводит к значительным потерям гемопоэтических предшественников (от 30 до 50%) [32]. Сепарация в градиенте плотности, где в качестве основы использую"1 фиколл (Ficoll-Hypaque) с плотностью d- 1,077 г/мл или перколл (Percoll)c плотностью d= 1,069 г/мл, является одним из наиболее распространенны* методов сепарации при лабораторных исследованиях. Сохранность ГСК после сепарации в градиенте плотности составляет 92%, а потеря клеток пр"

92

использовании перколла меньше, чем при использовании фиколла [49]. использование перколла с плотностью 1,080 г/мл позволяет уменьшить объем пробы пуповинной крови до 10 мл, а содержание ГСК в таком объеме достаточно для проведения трансплантации пациенту с весом менее 10 кг [50]. использование градиентов плотности растительного происхождения позволяет удалить значительное число эритроцитов, однако при последующей криоконсервации вещества полисахаридной природы могут приводить к осмотическому шоку и гибели ГСК. Важными недостатками данного метода является его длительность (около 2,5 часа) и необходимость использования иромежуточных емкостей, прямо контактирующих с биологическим материалом, что повышает вероятность контаминации образца.

Для седиментации и последующего удаления эритроцитов могут быть использованы такие агглютинирующие вещества, как желатин, полиглюкин и гидроксиэтиленкрахмал. Седиментация с помощью 3% раствора желатина позволяет сохранить до 86% ГСК и удалить 96,4% эритроцитов, эта процедура занимает меньше времени, чем сепарация в градиенте плотности: 1,5 ч вместо 2,5 [20, 51]. Несмотря на значительный уровень деплеции эритроцитов и высокую сохранность ГСК, серьезной проблемой является способ получения желатина. Желатин—вещество ксеногенного происхождения, которое перед использованием не тестируют на присутствие инфекционных агентов. После криоконсервации желатин очень сложно удалить, поэтому в медицинской практике трансплантаций отказались от его использования для подготовки образцов пуповинной крови к хранению.

Полиглюкин также используют для осаждения эритроцитов в образцах пуповинной крови. При оптимальном соотношении полиглюкина и пуповинной крови 1:1 уровень деплеции эритроцитов составляет около 97%. Важно отметить, что после использования полиглюкина нет необходимости проведения отмывок образцов [52].

Наиболее распространенный метод неавтоматической сепарации пуповинной крови, предложенный Rubinstein et al. в 1995 г. [49], основан на ускорении седиментации эритроцитов при добавлении 6% гидроксиэтиленкрах-мала. После удаления осевших эритроцитов получают надосадок, обогащенный лейкоцитами. Последующее центрифугирование (400 х g, 15 мин) позволяет осадить клетки и удалить плазму, уменьшая объем пробы. Сохранность ГСК при использовании данного метода составляет 87,4%, а его стоимость в 2,2 и 4,1 раза ниже, чем стоимость методов, основанных на применении перколла и Фиколла соответственно [53].

Современным направлением фракционирования пуповинной крови является использование систем фильтров и автоматических сепараторов. В системе StemQuickTM (Asahi Medical, Japan) в качестве фильтра используют Многослойный нетканый полиэтилен терефталат, покрытый гидрофильным полимером. При фильтрации крови с внесенным антикоагулянтом эритроциты ^ тромбоциты проникают через поры в собирающий (стоковый) контейнер, а Фильтр задерживает лейкоциты. На втором этапе потоком жидкости (раствор На основе альбумина сыворотки человека и декстрана 40 в соотношении 3:16) "Лросодержащие клетки смывают с поверхности фильтра в специальный

93

контейнер. Данный метод позволяет выделить 79,5% лимфоцитов, средня» длительность процедуры — 30 мин [54]. В опытах с NOD/SCID мышами прц исследовании приживления ГСК, полученных в результате фильтрации пуповинной крови, не было обнаружено различий по сравнению с приживлением ГСК из образцов цельной ПК [55].

Методы культивирования ГСК человека in vitro.

Другим интенсивно развиваемым направлением является так называемое раз­множение количества ГСК ex vivo. Под этим термином из английского языка на самом деле понимается обогащение ГСК, производимое in vitro. Эта про­цедура требует сложных методов биологического культивирования и специаль­ных методов сохранения ГСК [56—59]. Используя различные методики культи­вирования ГСК, можно увеличить число ядросодержащих ГСК до 20 раз (в биореакторах до 1000 раз) в исходной клеточной культуре. В опытных условиях показано, что культивирование клеток CD 34+ из пуповинной крови в присут­ствии цитокинов в течение 14 дней более значительно усиливает клеточный потенциал трансплантата, чем аналогичное культивирование в течение 7 суток. Разрабатываются и более эффективные новые методы культивирования. Один из них состоит в том, чтобы создать условия в культуре, когда при увеличении числа СК будут блокированы возможности их дифференцировки [4].

Существуют также методы культивирования ГСК, где клеточную суспензию, полученную из пуповинной и периферической крови, а также костного мозга высевают на фидерный слой (эмбриональные фибробласты мыши или стромальные клетки человека). Посевная концентрация составляет от 3 х 104 до 2 х 105 кл/мл. Для культивирования используют смесь питательных сред RPMI—1640 и IMDM в соотношении 1:1, содержащую 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глюта-мина, 5 х 10~5 2-меркаптоэтанола и 10% фетальной сыворотки теленка. Для культивирования по Декстеровскому типу использовали питательную среду IMDM, содержащую 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 20% лошадиной сыворотки и Ю-6 М гидрокортизона. Клетки, выращенные в среде по Декстеровскому типу, производят только миелоидное дифференцирование [60].

Таким образом, как было выше сказано, при выделении ГСК из первичного материала количество клеток совершенно недостаточно для проведения эффективной клеточной терапии взрослому человеку. Следовательно, отработка методов культивирования ГСК в условиях in vitro является основной задачей при выполнении данного проекта НИР.

Материалы и методы исследований.

Образцы крови:

— лейкоцитарная масса из пуповинной крови, предоставленная ТОО "Стэмкорд";

—лейкоцитарная масса из периферической крови, предоставленная РГП "Национальный научный центр хирургии" (ННЦХ) им. А. Н. Сызганова.

Реактивы, среды и растворы, оборудование.

Для проведения исследований использовали готовые жидкие питательные среды, а также среды, изготовленные из отдельных компонентов "

94

аминокислот, витаминов, неорганических солей, глюкозы, антибиотиков. Для прцготовления сред и растворов использовали:

—14 аминокислот в L-форме (аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лгейцин, дизин, метионин, серии, треонин, тирозин, триптофан, фенилаланин, щистин, гЛутамин) производства фирм "Sigma" (США), "Мегск", "ROTH" (Германия), «флюка" (Швейцария);

— 8 витаминов (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, инозит, никотинамид, пантотенат, фолиевая кислота, холинхлорид) производства фирм "Sigma" и "Мегск";

—10 неорганических солей производства стран СНГ и зарубежныж фирм классификации "осч" и "фарм";

Изготовление, контроль качества и хранение питательных сред и растворов осуществляли согласно прилагаемым к препаратам инструкциям и наставле­ниям, а также по инструкции, отработанной в институте [61].

При проведении НИР использовали следующее оборудование:

95

• автоматические микропипетки, Eppendorf (Германия).
Методы исследований.

Сбор пуповинной и периферической крови и транспортировка первичного материала.

Сбор пуповинной крови проводили открытым и закрытым способами. Открытым способом забор пуповинной крови осуществляли после рождения ребенка и отделения его от последа, когда плацента еще находилась in utero (открытый способ). Сбор осуществляли в стерильные 500 мл флаконы, содержащие фосфатно-буферный раствор с добавлением антикоагулянта (очищенный раствор гепарина без консерванта) в дозе 20 ед/мл. Для стерильного взятия пуповинной крови закрытым способом использовали специальную трансфузионную систему, содержащую антикоагулянт, и оснащенную дренажной иглой (Гемокон, Россия). Доставку указанных образцов пуповинной крови из родильного дома г. Алматы и из ТОО "Стэмкорд" осуществляли в термоконтейнерах (2—4°С) и в медицинских биксах при температуре 20°С автомобильным транспортом.

Для стерильного взятия периферической крови также использовали специальную трансфузионную систему, содержащую антикоагулянт, и оснащенную дренажной иглой (Гемокон, Россия) и в виде лейкоцитарной массы, доставленную из ННЦХ им. А. Н. Сызганова в термочемоданах при температуре 2-4°С.

Жизнеспособность клеток пуповинной и периферической крови при тран­спортировке изучали при температурах 2-^ГС и при 20°С в течение 24—48 ч.

Метод центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque.

Образцы пуповинной крови наслаивали в пробирки по 7 мл поверх 3 мл Ficoll-Paque с плотностью d = 1,077 г/м в центрифужных пробирках. Центрифугирование проводили при 1800 об/мин (921g) в течение 30 мин при комнатной температуре (20°С). После центрифугирования отбирали межфазный слой клеток в виде серовато-белого кольца с помощью стерильной иглы, соединенной через силиконовый шланг с перистальтическим насосом. Затем межфазный слой клеток разводили в питательной среде DMEM/F12 в соотношении 1:9с целью отмывки от фиколла. Отмывку проводили 3 раза в охлажденной среде DMEM/F12 следующим образом:

первая отмывка: 1400 об/мин 15 мин, 4°С;

вторая отмывка: 1200 об/мин 10 мин, 4°С;

третья отмывка: 1200 об/мин 10 мин, 4°С.

После третьей промывки клетки суспендировали в среде DMEM/F12 и подсчитывали общее количество жизнеспособных клеток методом окраши­вания 1% раствором трипанового синего с помощью камеры Горяева.

Метод выделения клеток с помощью лизирующего раствора.

В образец пуповинной крови добавляли лизирующий раствор, состоящий из хлорида аммония, гидрокарбоната калия и натриевой соли этилендиамин-тетрауксусной кислоты, в соотношении 1:9. Полученную смесь пуповинной крови с лизирующим раствором выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре (20°С). По истечении данного времени проводили центрифуги­рование при 1000 об/мин в течение 15 мин. После этого надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде DMEM/F12 и определяли количество жизнеспособных клеток путем окрашивания 1% раствором трипанового синего с последующим подсчетом неокрашенных клеток в камере Горяева. При использовании лизирующего раствора для дальнейших работ отбирали осадочный слой клеток.

Методы получения мононуклеарной фракции пуповинной крови человека с использованием желатина.

Цельную гепаринизированную кровь наслаивали на 3% раствор желатина в соотношении 1:3. Седиментацию эритроцитов проводили при комнатной температуре в течение 40 мин. Затем отбирали 1/3 часть верхнего слоя, содер­жащую мононуклеарную фракцию крови, а осадок отбрасывали. Далее с целью избавления от желатина отобранную мононуклеарную фракцию разбавляли питательной средой в соотношении 1:10 и проводили центрифугирование при 1000 об/мин в течение 15 мин. Отмывку проводили 3-кратно, как указано выше.

В полученной клеточной суспензии определяли содержание общего количества клеток и их жизнеспособность с использованием 1% раствора трипанового синего.

Определение содержания CD 34+ клеток в образцах пуповинной крови и исследование на наличие посторонней инфекции.

В полученных 9 образцах пуповинной крови было определено количество CD 34+ клеток с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur. Проточная цитофлуориметрия основана на анализе оптических свойств единичных клеток в потоке. Окрашенная флуорохромами фикоэритрин (РЕ) и FITC (Fluorescein isothiocyanate) суспензия клеток подается в специальную камеру, где с помощью гидродинамической фокусировки обеспечивается прохождение клеток через точку анализа по принципу одна за другой. В точке анализа флуоресценция флуорохрома возбуждается лазерным лучом. Далее флуоресцентный сигнал проходил через систему оптических фильтров, обеспе­чивающих выделение интересующей длины волны (цвета) и анализируется при помощи ФЭУ. Подобная система позволяет оценивать количество Флуорохрома (количество антител), находящегося (находящихся) на данной Клетке. Управление прибором, сбор данных и представление результатов осуществляются при помощи персонального компьютера. Конечный результат анализа представляется в форме двухмерных цитограмм. Исследования Проведены на базе лаборатории медицинских иммунологических препаратов Национального центра экспертизы лекарственных средств, изделий

97

медицинского назначения и медицинской техники Министерства здравоохра­нения Республики Казахстан (г. Алматы).

Образцы пуповинной крови исследовались на наличие 10 патогенных инфекций (гепатит А и В, ВПГ —1/11, ЦМВ, сифилис, токсоплазмоз, ВЭБ, I ВИЧ, HTLVI/II и бруцеллез) и проводились гемоцитометрические анализы ] образцов на базе лаборатории иммунологии и аллергологии ТОО "Стэмкорд" ] (г. Алматы).

Методы выделения ГСК с фенотипами CD 34+ и CD 133+ из образцов пуповинной и периферической крови с помощью иммунномагнитного сепаратора.

Выделение ГСК с помощью иммуномагнитного сепаратора состоит из следующих подготовительных этапов:

Приготовление клеток пуповинной и периферической крови.

Образцы пуповинной крови с антикогулянтом, содержащим 2 мМ EDTA I или 0,6% ACD-A в соотношении 1:4 в фосфатно-буферном растворе (ФБР), I аккуратно наслаивали на 15 мл Ficoll-Paque® в количестве 35 мл. После этого f центрифугировали на горизонтальном бакет-роторе при 400 g в течение 35 мин при температуре 20°С (без торможения). Затем удалили верхний слой, оставляя не разрушенным слой мононуклеарных клеток в интерфазе, аккуратно собирали клетки интерфазы и дважды отмывали ФБР, содержащий 2 мМ EDTA или 0,6% ACD-A, в течение 10 мин при 200 g (20°С). Полученный осадок кле- 1 ток ресуспендировали в конечном объеме 300 мкл буфера на 108 общего коли­чества клеток.

Магнитное мечение CD 34+ клеток предшественников.

На 100 мкл FcR блокирующего реагента добавили 108 клеток в объеме 300 мкл и перемешивали. Затем вносили 100 мкл гаптеновых антител (Hapten- I Antibody), вновь перемешивали и инкубировали в течение 15 мин при 6°— 12°С. Конечный объем меченых 108 клеток составлял 500 мкл. После этого меченые клетки аккуратно промывали с добавлением 10—20-кратного объема ФБР (5—10 мл на 108 клеток), центрифугировали и полностью удалили надо-садок. Полученный осадок клеток аккуратно ресуспендировали и заполнили буфером, доводя конечный объем до 400 мкл с концентрацией клеток 108.

К полученной суспензии клеток вносили 100 мкл микробусинок с антигаптеновыми антителами (Anti-Hapten MicroBeads), после чего хорошо перемешивали и инкубировали в течение 15 мин при 6—12°С. После этого клеточный осадок с концентрацией 108 клеток промывали и ресуспендировали в 500 мкл буфера.

Магнитное мечение CD 133+ клеток предшественников.

Для мечения CD 133+ клеток, 100 мкл FcR блокирующего реагента вносили к ресуспендированным клеткам в объеме 300 мкл с концентрацией 108 клеток в фосфатно-солевом буфере, чтобы препятствовать неспецифическому связыванию антител с Fc-рецепторами клеток. Затем к меченым клеткам добавляли 100 мкл микробусинок с конъюгированными антителами к CD 133+ клеткам. После этого хорошо перемешали и инкубировали в течение 30 мин при 4—8°С. Отмывку клеток проводили путем добавления 10—20-кратного объема буфера с последующим центрифугированием при 300 g в течение 10 мин.

98
|Надосадок удаляли с помощью пипетки и клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера. Таким образом, меченые CD 34+и CD 133+клетки из образцов пуповинной и периферической крови были готовы для проведения следующего основного этапа магнитной сепарации клеток. Магнитная сепарация меченых CD 34+и CD 133+клеток. Колонку MS с адаптером помещали в магнитное поле сепаратора MniMACS и наполнили буфером MS—500 мкл и промывали. После этого клетки пропус­кали через пресепарационный фильтр, представляющий собой нейлоновое сито с размером пор 30 мкм для удаления конгломератов клеток. Пресепара­ционный фильтр перед применением смачивали буфером. Затем очищенные клетки (меченые) помещали в колонку MS и промывали трижды буфером по 500 мкл. Колонку с мечеными клетками удаляли из магнитного поля и поме­щали ее в подходящую пробирку. На колонку наносили буфер в количестве 1 мл и смывали удержанные клетки, используя поршень, поставляемый с колонками.

Жизнеспособность полученных ГСК с фенотипами CD 34+ и CD 133+ определяли путем окрашивания 1%-ным раствором трипанового синего с последующим подсчетом в камере Горяева.

Культивирование гемопоэтических стволовых клеток. Для подбора оптимальной питательной среды культивирования ГСК использовали среды ПСП, L-15, DMEM/F12 и RPMI-1640, содержащие 20% фетальной сыворотки КРС при 37°С, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки высевали в культуральные 24-луночные плашки. Концентрацию для посева получали дополнительным разведением клеток ростовой средой и конечную концентрацию доводили до 1 х 10б клеток на см3 среды. Во время культивирования проводили ежедневное микроскопирование культуральных плашек с культурой клеток с помощью инвертированного микроскопа. Смену среды в культуральных плашках с клетками проводили через 4—5 сут. Микрофотосъемку культуры ГСК проводили с помощью инвертированного микроскопа со встроенной цифровой камерой "KRUSS".

Результаты исследований.

Результаты определения оптимального метода забора пуповинной крови.

Количество проб и объем взятых образцов пуповинной крови открытым и закрытым способами, предоставленные сотрудниками ТОО "Стэмкорд" приведены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, при закрытом способе сбора средний объем получаемой крови составляет 102 ± 23,7, при открытом несколько меньше — 75 ± 29,5 мл. При открытом способе забора 2 пробы из четырех оказались Нестерильными, тогда как при закрытом способе все пробы, взятые с применением специальной трансфузионной системы, содержащей антикоагу­лянт и оснащенной дренажной иглой, были стерильными. Полученные данные свидетельствуют о преимуществе закрытого способа забора пуповинной крови из-за большого объема и низкой вероятности микробной контаминации. По количеству собранного материала закрытый способ также имеет преимущество Перед открытым способом.

99

Таблица 1 Сравнительные данные методов забора пуповинной крови

№ Методы Образцы Объем проб Средний объем, Стерильность,

п/п забора пупо- проб с антикоагу- мл Х±т,п = 5 МПА, МПБ,

винной крови лянтом, мл Сабуро

  1. Открытый Донор № 1 60 75 ± 29,5 Нестерильно

  2. способ Донор № 2 130 Стерильно




  1. Донор № 3 80 Стерильно

  2. Донор № 4 30 Нестерильно




  1. Закрытый Донор № 1 100 102 ± 23,7 Стерильно

  2. способ Донор № 2 90 Стерильно




  1. Донор № 3 ПО Стерильно

  2. Донор № 4 120 Стерильно

  3. Донор № 5 80 Стерильно '"

  4. Донор № 6 120 Стерильно

  5. Донор № 7 150 Стерильно

  6. Донор № 8 80 Стерильно

  7. Донор № 9 70 Стерильно

Результаты определения оптимального температурного режима транспорти­ровки представлены в табл. 2.

Таблица 2 Сравнительная характеристика сохранности ядросодержащих клеток

Продолжительность Выживаемость клеток при

хранения, ч различных температурных режимах, %

2-4°С I 20°С

24 92Д 90Д

48 88,2 8^9

72 61J3 56,3

Данные, полученные нами, свидетельствуют, что при транспортировке и хранении пуповинной крови при комнатной температуре (20°С) или при 2-4°С в течение 24—48 ч жизнеспособность клеток пуповинной крови не снижалась и составляла соответственно 92% и 88%. Однако при хранении образцов крови в течение 3 суток отмечалось значительное снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток. Полученные данные по определению оптимальных условий выделения и транспортирования первичного материала также подтверждаются данными, полученными другими авторами [62—64].

Таким образом, при отработке условий транспортировки и хранения образцов пуповинной и периферической крови доставка материала должна осуществляться в течение не более чем 24 ч и при температуре не выше 2—4°С,

100

так как комнатную температуру не всегда №"~'К

возможно выдержать в условиях автотран­спорта, в особенности в летнее время.

Результаты определения оптимального
метода выделения ядросодержащих клеток из
образцов пуповинной и периферической крови. | ^

При использовании метода седиментации пуповинной крови на градиенте плотности Ficoll-Paque с плотностью 1,077 г/м использо­вались клеточные элементы, находящиеся в межфазном слое. Фотография образца пупо­винной крови после центрифугирования на градиенте плотности фиколла представлена на

Сравнительные результаты выделения В

мононуклеарной фракции из пуповинной А. крови методом седиментации на градиенте плотности Ficoll-Paque, обработки лизи-руюшим раствором и осаждения на 3% раство­ре желатина представлены в табл. 3.

Как видно из данных таблицы, при выделе­нии ядросодержащих клеток из первых трех образцов с использованием 3%-ного раствора

желатина было отмечено быстрое осаждение и^мгпцдг

клеточных элементов в течение первых минут в виде крупных фракций. После 40-минутной

седиментации В среде, находящейся на поверх- Рис- *• Центрифугирование на
ности желатина, клеточных элементов обнару- градиенте плотности Ficoll-
жено не было. Вследствие того, что использо- Paque.

ванный нами желатин не удовлетворял требо- А ~ межфазный слой

ваниям для седиментации клеток, данным мононуклеарных клеток

методом изолировать мононуклеарную фрак- пуповинной крови

цию клеток не удалось.

Выделение ядросодержащих клеток из 4 образца проводили согласно методу, описанному Raj endra N. Pahwa и др. [65], в результате чего нами были выделены клетки в количестве 1,7 млн. в указанном объеме.

Изоляция мононуклеарных клеток методом обработки пуповинной крови лидирующим раствором приводит к получению большей массы клеток по срав­нению с методом градиентного центрифугирования на Ficoll-Paque и 3%-ного раствора желатина.

Кроме того, было проведено выделение мононуклеарной фракции клеток Из лейкоцитарной массы периферической крови человека. Кровь была отобрана от здоровых доноров с помощью специальной трансфузионной системы (Гемокон, Россия), закрытым способом. Мононуклеарную фракцию Клеток из периферической крови выделяли методом градиентного центри­фугирования с использованием Ficoll-Paque. Фотография образца перифери-

101

Таблица 3 Сравнительные данные выделения ядросодержащих клеток из образцов пуповинной крови

Методы Объем материала Средний объем Общее коли- Среднее коли-

выделения с антикоагулянтом, материала, чество клеток, чество клеток

мл мл Х±т млн. кл. млн. кл. Х±щ

1 Градиентное 150 46,0 42,0 ± 1зУ~
центрифуги- 120 117 ±29 56,4

рование на 80 23,5
Ficoll-Paque

2 Лизирую- 150 108 ±20 61
щий 120 90

раствор 100 - 163,5 106,3 ± 35
90 110,8
80 44^9

3 3%-ный 120 95,0 ±14 - -
раствор 100 —

желатина 90 —
| 70 I | 1,7 |

Примечание: "—" — отсутствие клеток.

ческой крови после центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque представлена на рис. 2.

После этого отбирали меж­
фазный слой мононуклеарных
мнм| клеток и проводили отмывку от

фиколла путем центрифугирования при 200 g в течение 10 мин. Затем клетки подсчитывали. Результаты по определению количества ядро­содержащих клеток представлены

Как видно из данных таблицы,
полученное количество ядросо­
держащих клеток из исследуемых
образцов периферической крови
■А щ достаточно для дальнейшей работы

по изоляции ГСК с фенотипами
CD 34+ и CD 133+на иммунномаг
нитном сепараторе MiniMACS,
который позволяет выделить более
97% гемопоэтических стволовьгХ
клеток.
Рис. 2. Центрифугирование на градиенте Результаты определения содеР'

плотности Ficoll-Paque. жания CD ^+eT0K B образШ*

А - межфазный слой мононуклеарных ПУПОВИННОЙ крови методом прОТОЧ'

клеток периферической крови ной Цитофлуориметрии.

102

Таблица 4 Выделение мононуклеарной фракции клеток из лейкоцитарной массы периферической крови человека

Метод выделения Объем Общее Среднее

п/п материала, количество количество

мл клеток, млн. кл. клеток, млн. кл.

1 Градиентное центрифугирование 50 103,360

99,6

2 на Ficoll-Paque 50 95,840

Было исследовано 9 образцов пуповинной крови, собранной закрытым способом, на содержание CD 34+ клеток. В качестве контроля работы проточного цитофлуориметра был использован маркер CD 15.

График анализа полученных данных представлен в виде двухмерной цитограммы на рис. 3—11.

На данных рисунках анализа исследованных образцов пуповинной крови на левой цитограмме показана селекция лимфоцитов в соответствии с их светорассеянием. На правой цитограмме показан процент клеток в соответствии с их окрашиванием при сочетании CD 34+ и CD 15+ моноклональных антител. К примеру в образце пуповинной крови донора № 1 (рис. 3) клетки в правой цитограмме распределены следующим образом — Al(TJL) — 0,58% CD 34 положительных клеток; А2 (UR) — 0,18% CD 34 и CD 15 положительных клеток; A3 (LL)—31,66% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера; А4 (LR) — 2,7% CD 15 положительных клеток.

onko1.002 v,- qnkol.002

Pi " ,.,«..-.— ——г-'- ■ ■ _■■-■■■- О-

§ " ■ '.*•:'•*. •-•■ • ''•:- ,"■" \\ I А1-о,58% | , .

• ""..:■. '•%".. • ' ' "• '"'"*-;• • | А2-о,18%|

0 ""Ч^и600 ш 1шо S id*'"'*]к>'' ' '"То* 'к? ю4

F&C"H , 1— , FL1-H

| А3-31,66%|

Рис. 3. Образец пуповинной крови донора № 1

А1 — 0,58% CD 34 положительных клеток;

А 2 — 0,18% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 31,66% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—2,7% CD 15 положительных клеток.

юз

V

onkol.002 » onto 1.002

S"T~ "i I A 1-2.1% I . ,

"..I-. i% '.-• ' - ' %'*'■; | A2-0.23% [

о 200 400fsc_h60o 800 looo s itf p& "70г io' io'

|A3-33,95%| FL1"H

Рис. 4. Образец пуповинной крови донора № 2

А1 — 2,1 % CD 34 положительных клеток;

А 2—0,23% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 33,95% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—2,3% CD 15 положительных клеток.

onkol.002 -'„-, onko 1.002

8: ' . •;.• ■ !

" : ■'. •' . ..-,". ".'.'• » * .'« •'••• V." : | Д1-2,4% | | А2-0,19% |

0 200 "«'рзсн600 ^ 1Ш0 3 /0оТҐ"У°^ ' ^2 ■ '■ ■ ""^з 'ft 1

|АЗ-31,35%| FL1_H

Рис. 5. Образец пуповинной крови донора № 3

А1 — 2,4% CD 34 положительных клеток;

А 2 — 0,19% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 31,35% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 3,07% CD 15 положительных клеток.

104

onkol.002 -а,-, onko1.002

§: .;/"■ ;".-_ •■"- : | ai-2.6% | | а2-о,31% |
""fsc-h600 80° 1Ш0 Э ю°" io1 ' io2 io3 io'

r 1 .т. FL1-H

|A3-32,51%]

Рис. 6. Образец пуповинной крови донора № 4

А1 — 2,6% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,31% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3—32,51 % клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—2,16% CD 15 положительных клеток.

onko 1.002 »0 onko1.002

о" ■'.; Д ~~ \ | А1-3.3% | | А2-0.26%|

о 200 400 psc нбю 800 looo s I0 "" F'i'o' ' i6" 3 io"

|АЗ-32.81%'1 FL1"H

Рис. 7. Образец пуповинной крови донора № 5

А1 — 3,3% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,26% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

A3 — 32,81% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 2,74% CD 15 положительных клеток.

105

о , , onko1.002 . onkol.002

"*: _■'• ■■'."■,•:, '""'. : ,':*"л.; I I am,98%| I A2-o;iSgi

«FSC-H600 ' m 100° " ^^ff ' f'^: ' ' lo"""]

|A3-33,72%|

Рис. 8. Образец пуповинной крови донора № 6

А1 —1,98% CD 34 положительных клеток;

А 2 — 0,16% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3—33,72% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А4—1,12% CD 15 положительных клеток.

о onko1.002 ( , onko1.002

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


Учебный материал
© bib.convdocs.org
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации