Алиев. Современные клеточные технологии в медицине - файл n1.doc

Алиев. Современные клеточные технологии в медицине
скачать (1468 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc1468kb.21.10.2012 09:57скачать

n1.doc

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
§: * .; "-.'•:';".. -•• ~ ! I А1-2,28%| |А2-0.12%|

0 20° ^fsc-h600 m 1Ю0 i°° ~ '"W ' ' "^ ю3 i''

|АЗ-33,03%| FL1"H

Рис. 9. Образец пуповинной крови донора № 7

А1 — 2,28% CD34 положительных клеток;

А 2—0,12% CD34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 33,03% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 1,73% CD15 положительных клеток.

onko1.002 - onko1.002

|" ' . "-:'-". ■■•■ : '"•■'''.^: ./'/■• "; I A1-1.82% | | A2-0,16% |

о 200 ^fsc.h600 800 100° ° 10°' Tip1 ' "io2 "w' i'o

|A3-32,32%| FL,"H

Рис. 10. Образец пуповинной крови донора № 8

А1 — 1,82% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,16% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3—32,32% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 2,17% CD 15 положительных клеток.

onkot.002 -0 orikol 002

§Н "■ '■ ; г- /,- ' ' | " ! | А1-2.01%| |А2-0,24%|

0 200 400 psc н600 Ю0 WOO S ib° '"'"' |fo' ' ' "'lV 'lQ3 Го"

|A3-33,03%| FL1"H

Рис. 11. Образец пуповинной крови донора № 9

А1 — 2,01% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,24% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 33,03% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—1,78% CD 15 положительных клеток.

Количественное отношение CD 34+ позитивных клеток к общему числу клеток в вышеприведенных образцах представлено в табл. 5.

Как видно из данных таблицы, во всех образцах пуповинной крови количество CD 34+ клеток не превышает более 3,30% от общего количества мононуклеарных клеток, что подтверждают данные, полученные другими исследователями.

Два образца после культивирования in vitro из исследованных девяти проб были повторно исследованы на проточном цитофлуориметре с целью определения количества CD 34+ клеток в условиях лаборатории медицинских

107

Процентное содержание CD34+ клеток в образцах пуповинной крови

№ Образцы Общее Общее Общее Процентное

п/п пуповинной количество количество количество соотношение

крови мононуклеарных клеток CD 34+ клеток CD 34+ клеток

клеток лимфоцитов

  1. Образец 1 10000 3512 58 0,58

  2. Образец 2 3651 210 ~ 2,10

  3. Образец 3 3758 260 2,60

~4 Образец 4~~ 3911 330 3,30 ~~"~~

  1. Образец 5 3701 240 2,40

  2. Образец 6 3698 198 1,98

  3. Образец 7 3716 228 ~ 2,28 ^~

8 Образец 8 3682 182 1,82
~9 Образец 9 3706 201 2ДН

иммунобиологических препаратов Национального центра экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники Министерства здравоохранения Республики Казахстан.

Результаты проточной цитофлуориметрии культивированных клеток показали, что в суспензии СК с фенотипом CD 34+не были обнаружены. Анализ данных проточной цитофлуориметрии показал, что исследуемые клетки не попадают в область задаваемых параметров, что в свою очередь свидетель-

Рис. 12. ГСК в поле зрения камеры Горяева. Стрелками указаны ГСК с фенотипом CD 34+

108

^гвовало о большом размере клеток, характерном для клеток макрофагального

типа.

Результаты выделения ГСК с фенотипом CD 34+ и CD 133 из перифери­ческой крови человека с применением иммуномагнитного сепаратора.

В результате проведенных исследований из двух образцов лейкоцитарной массы периферической крови человека были получены ГСК с фенотипами CD 34+и CD 133+ с использованием иммуномагнитного сепаратора MiniMACS (jVliltenyi Biotec, Германия). После чего проводили подсчет ГСК с указанными фенотипами с помощью камеры Горяева. Фотография ГСК в поле зрения камеры Горяева под микроскопом представлена на рис. 12.

Выделение ГСК, меченых CD 34+ и CD 133+ антителами, на иммуномагнит-ном сепараторе проводилось однократно, и учитывались только жизнеспо­собные клетки. Количество ГСК с указанными фенотипами представлено в табл. 6.

Таблица 6 Количественный анализ ГСК из периферической крови

Объем Содержание моно- Меченые Меченые

п/п исследуемого нуклеарной фракции по CD 34+, млн. по CD 133+, млн.

материала жизнеспособных

клеток, млн.

  1. 50 103,360 7,62 -

  2. 50 95,840 - 47)0

Как видно из таблицы, при применении магнитного сепаратора клеток удается получить из малых объемов образцов (проб) достаточное количество клеток для дальнейшего их культивирования.

Результаты по определению принципиальной возможности культивирования ГСК.

Полученные меченые клетки культивировали в 24-луночных культураль-ных плашках с использованием питательных сред DMEM/F12 и RPMI-1640 с 20%-ной фетальной сывороткой при 37°С в увлажненной атмосфере с содержанием 5% С02. При указанных условиях культивированию подверга­лись также и другие типы клеток (немеченые клетки) после магнитной сепарации с посевной концентрацией 1 млн. клеток в 1 мл.

Как видно из рис. 13, гемопоэтические стволовые клетки морфологически подобны лимфоцитам и представляют собой относительно однородную совокупность круглых клеток. В результате наблюдения и ежедневного микроскопирования в течение 20 дней размножения выделенных меченых и Немеченых клеток не наблюдалось.

На рис. 14—15 представлены культура гемопоэтических стволовых клеток с фенотипами CD 34+ и CD 133+ на 3 и 6-е сутки культивирования (соответ­ственно), изолированные с помощью магнитного сепаратора из моно-Нуклеарной фракции периферической крови.

Из данных рисунков видно, что на ранних сроках культивирования ГСК с

109

< • "-'V: . '.. ':'

' '*Ј о И

^^Kpv "'it* n-*.t

bBBdHHHI ' ij

Рис. 13. ГСК пуповинной крови на 3-й сутки культивирования. А — ГСК с фенотипом CD 34+ . Ув. хЮО (фазово-контрастный)

фенотипами CD 34+ и CD 133+ в культуре по морфологическим признакам схожие. Все клетки округлой формы, на вторые и третьи сутки наблюдается частичное прикрепление клеток на поверхности культуральной посуды, большая часть клеток находится во взвешенном состоянии, сохраняя при этом изначальную форму.

По мере культивирования после смены питательной среды неприкреплен­ные клетки удаляются, а прикрепившиеся клетки начинают изменять свою

/ t ■'■■ **':-&**Ј^И

Рис. 14. Гемопоэтические стволовые клетки периферической крови. Л - ГСК с фенотипом CD 34+ . Ув х 100

ПО

- .&*У- ■ .. -•,' ^*

«о 8 "° /Л',* " ° .. <а

; о - ^ ^ " оо ^

, йда ' ^^—Яо;!5

Рис. 15. Гемопоэтические стволовые клетки периферической крови. /1 - ГСК с фенотипом CD133+. Ув х 100

r

Рис. 16. Культура ГСК на 10-е сутки культивирования.

А — колония ГСК, Б — мезенхимальные клетки В — гранулоциты,

Г— макрофаги

111

изначальную форму, характерную для ГСК. Клетки увеличиваются в размере цитоплазма становится зернистой и появляются формы клеток, по своей морфологии схожие с макрофагами.

На рис. 16 представлена культура ГСК с фенотипом CD 34+ на 10-е сутки культивирования. Как видно из рисунка, в процессе культивирования ГСК отмечается образование колоний (А), состоящих из мелких округлых клеток, характерных для клеток, участвующих в гемопоэзе. Кроме того, к данному сроку культивирования в культуре отмечается появление фибробласто-подобных клеток (Б), крупных клеток с зернистой цитоплазмой (В) и клеток с ундулирующей (Г) мембраной.

Данные изменения в морфологии ГСК объясняются тем, что в ростовой среде отсутствуют факторы роста стволовых клеток (SCF) и интерлейкины (IL-3, IL-6, LIF), которые регулируют межклеточные взаимодействия, определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию, функциональную активность и апоптоз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами проведены исследования по определению оптимального метода сбора пуповинной и периферической крови, метода их транспортировки. Проведены эксперименты по отработке оптимальных методов выделения ядросодержащих клеток из пуповинной и периферической крови человека. Указанные источники ГСК исследовались на наличие возбудителей вирусной и бактериальной инфекции. В первичном материале определяли количество CD 34+ клеток путем проточной цитофлуориметрии.

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальным методом забора пуповинной крови является закрытый способ, обеспечи­вающий большой объем собираемой пуповинной крови и низкую вероятность микробной контаминации. По количеству собранного материала закрытый способ также имеет преимущество перед открытым способом.

Данные, полученные при определении оптимального температурного режи­ма транспортировки, свидетельствуют, что при доставке и хранении пуповин­ной крови при комнатной температуре (20°С) или при 2-4°С в условиях термо­чемодана с хладоагентами в течение 24—48 ч жизнеспособность клеток пуповин­ной крови не снижалась и составляла соответственно 92% и 88%. Однако при хранении образцов крови в течение 3 суток отмечалось значительное снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток. Таким образом, транспортировка и хранение образцов пуповинной и периферической крови должны осуществляться в течение не более 24 ч и при температуре не выше 2—4°С.

При выделении ядросодержащих клеток из первичного материала опти­мальным методом является использование фиколла с плотностью 1,077 г/мл и лизирующего раствора. Обработка пуповинной и периферической крови указанными методами приводит к получению большей массы клеток по сравнению с методом обработки раствором 3%-ного желатина. Однако использование лизирующего раствора в наших условиях являлось оптималь­ным, по сравнению с фиколлом из-за доступности компонентов, применяемы* в приготовлении данного раствора.

112

Нами отработан метод выделения ГСК с фенотипом CD 34+ и CD 133+ клеток из полученных мононуклеарных фракций образцов пуповинной и перифери­ческой крови с помощью иммуномагнитного сепаратора MiniMACS (Milteny Biotech, Германия), с последующим определением количества указанных клеток путем подсчета в камере Горяева и на проточном цитофлуориметре.

Количество CD 34+ клеток определялось в пуповинной крови до культиви­рования и после культивирования in vitro. При этом установлено, что исследуемые клетки не попадают в область задаваемых параметров, что в свою очередь свидетельствует о большом размере клеток, характерном для клеток макрофагального типа. Все образцы пуповинной крови, использованные в работе, оказались стерильными в отношении контаминации возбудителями вирусных и бактериальных инфекций.

Проводили эксперименты по определению принципиальной возможности

культивирования ядросодержащих клеток и ГСК с фенотипом CD 34+ и CD 133+

| клеток в различных полусинтетических питательных средах, в результате чего

было установлено, что без применения в ростовой среде факторов роста

I цитокинов выделенные ГСК не обладали пролиферативными свойствами.

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы:

Отработка методов культивирования CD 34+ и CD 133+ ГСК с последующей дифференциацией в кардиомиоциты и методов криоконсервации является следующим объектом наших исследований при разработке технологии выделения и культивирования кардиомиоцитов из ГСК человека.

Литература

1. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. М.: Канон, 1995, 384 с. j 2. Мамадалиев СМ. и др. Биотехнология и сахарный диабет//Биотехнологая. Теория и практика, 2002. № 2. С. 62—64.

  1. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н. // Трансплантация островковых и других эндокринных клеток. В кн. "Трансплантация — руководство". М.: Медицина. Тула "Репроникс Лтд", 1995. С. 317-331.

  2. Алиев М.А., Рысулы М.Р. и др. Гемопоэтические стволовые клетки. Алматы: Мектеп, 2005, 136 с.

113 d

  1. Коркан И.П., Рысулы М.Р. Стволовые клетки в медицинской практике. Алматы 2004, 59 с.

  2. Хансон К.П., Моисеенко В.М., Балдуева И.А, Использование клеточных технологий в онкологии // Вестник РАМН. 2004. № 9. С. 58—61.

  3. Кокорев О.В., ЗайцевК.В., Волгушев С.А. Стволовые клетки — реальные перспек­тивы терапии. Сибирский медицинский журнал. 2006. №1. С. 86—94.

  4. Джонатан Сарфати. Статья опубликована в журнале TJ. 2001. Vol. 15(N 3) P. 19-26.

  5. Рябов СИ., Ракитянская И.А., Шутко А.Н. //Почки и системы иммунитета Л.: Наука. 1989. 135 с.

  6. Pittenger M.F., Mackay A.M., BeckS.C. et. al. // Multilineage Potential of Adult Hu­man Mesenhcymal Stem Cells// Scince 1999. V. 284, 2 april, P. 143—147.

1.1. MqjumdarM.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. // Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells //J. Cells Physiol 2000. V. 185. N.l. P. 98-106.

12. ВладимирскаяЕ.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А. и др. Биологические основы и
перспективы терапии стволовыми клетками. М.: Медпрактика. М., 2005, 392 с.

  1. Wenrong Xu and all. Mesenchymal Stem Cells from Adult Human Bone Marrow Differentiate into a Cardiomyocyte Phenotype In Vitro // Experimental Biology and Medicine. 2004. Vol. 229. P. 623-631.

  2. David Cameron. // Powerful technique for multiplying adult stem cells may aid thera­pies. // Eurek Alert., 2006. 22-Jan.

  3. Шевченко ЮЛ., Матвеев С.А. Клеточные технологии в сердечно-сосудистой хирургии. М.: Медицина, 2005. 160 с.

  4. Потапов И.В. и др. Характеристика насосной функции сердца после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и мезинхимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард. Вестник транспланталогии и искусственных органов. 2003. Т. 3. С. 50—55.

  5. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Потапов ИЗ., Башкина Л.В., Берсенев А.В. Костный мозг как источник получения мезенхи-мальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов. Вестник транспланталогии и искусственных органов. 2002. Т. 4. С. 7—11.

  6. Петренко А.Ю., Грищенко В.И. Трансплантация стволовых клеток — перспектив­ное направление терапии XXI в. 2. Стволовые кроветворные клетки из разных источников // Международный медицинский журнал, 2003. № 1. С. 123—129-

  7. Чертков ИЛ., Дризе Н.И. Как обеспечивается поддержание кроветворной систе­мы // Гематология и трансфузиология, 1998. № 4. Т. 43. С. 3—8.

  8. Абдулкадыров К.М., Романенко НА., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови // Вопросы онкологии. 2000. № 5. Т. 46. С. 513—520.

  9. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А. Плацентарная кровь: альтернативный источник кроветворных стволовых клеток для трансплантаций. Создание банко пуповиннои крови // Тер. архив. 2001. Т. 73. № 7. С. 76—78.

  10. Gluckman E., Broxmeyer H.E. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilica cord blood // N. Engl. J. Med. 2001. Vol. 344 (24) С 1860-1861.

  11. Gluckman, E., Rocha, Y., Boyer- Chammard, A. et al Outcome of cord-blood transpla tation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the Eur

114

pean Blood and Marrow Transplantation Group. // N Eingl J Med. 1997. Vol. 337(6). P. 373-381.

  1. Rubinstein, P., Carrier, C, Scaradavou, A. et al. Outcormes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Emgl J Med. 1998. Vol. 339(22). P. 1565-1577.

  2. Scott R. Burger Umbilical Cord Blood Stem Cells- Handbook of Transfusion Medicine Academic Press. 2001. P. 171-178.

  3. Kypmoea A.B., Зуева Е.Е., Фрегатоеа Л.М. Методы банкирования пуповиннои крови. Иммунология. 2005. Т. 6. С. 577—588.

  4. WattS.M., ContrerasM. Stem cell medicine: Umbilical cord blood and its stem cell potential // Seminars in fetal and neonatal medicine. 20Ю5. Vol. 10. P. 209—220.

  5. Румянцев А.Г., Масчан А.А., Дышлевая З.М. и др. Трансплантация пуповиннои крови у детей с различными заболеваниями // Материалы конференции "Биотехнология и онкология". СПб, 29—31 мая 2005 г. С. 59—60.

29- BertoliniF., BattagliaM. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns// Blood.

1995. Vol. 85. P. 3361-3362.

  1. Lazzari I., Corsini C, Curioni С et al. The Milan Cord Blood Bank and the Italian Cord Blood Network// J. Hematother. 1996. Vol. 5. N 2. P. 1Ц7—122.

  2. Rubinstein P., Taylor P.E., Scaradavou A. et al. Unrelated placental blood for bone marrow reconstitution: Organization of the placental blood program // Blood Cells. 1994. Vol. 20. N 2. P. 587-600.

  3. Boyse E.A., Broxmeyer HE., Douglas G.W. Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood// 1U.S. Patent 5.004.681. 1991. April 2.

  4. Kogler G, Calle/as J., Hakenberg P. et al. Hematopoietic transplant potential of unre­lated cord blood: critical issues // J. Hematother. 1996. Vol. 5. N. 2. P. 105—116.

  5. ArmitageS, FehilyD., Dickenson A. et al. Cord blood bankirng: volume reduction of cord blood units using a semi-automated closed system// Bome Marrow Transplant. 1999. Vol. 23. N. 5. P. 505-509.

  6. Isoyama K, Yamada K, Hirota Y. et al. Study of the collection and separation of umbilical cord blood for use in hematopoietic progenitor cell transplantation// Int. J. Hematol. 1996. Vol. 63. N 2. P. 95-102.

  7. NaglerA, StockheimD., Elchalal U. Harvesting of human urmbilical cord blood (HUCB) by various methods// Bone Marrow Transplant. 1998. Vol. 21. P. S24.

  8. Falkenburg J.H.F., Lim F. Т.Н. Использование пуповитаадй крови вместо костного мозга для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // РМЖ. 1996. Т. 3. № 4. С. 24-31.

  9. HarrisD. Т. Experience in autologous and allogeneic cord blood banking//J. Hematother.

1996. Vol. 5. N 2. P. 123-128.
39- Ikuta K. Cord blood stem cell transplantation and cord blood bank// Nippon Rinsho.

1998. Vol. 56. N 2. P. 521-530.

4°- Kogler G, Calle/as J., Hakenberg P. et al. Hematopoietic transplant potential of unre­lated cord blood: critical issues // J. Hematother. 1996. Vol. 5. N. 2. P. 105—116.

4l- Wagner Т.Е. Allogeneic umbilical cord blood transplantation// Cancer Treat. Res.

1997. Vol. 77. P. 187-216.
2- Юрасов СВ., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. и др. Выделение гемопоэтических

стволовых клеток из пуповиннои крови человека для тгрансплантации// Гемато­логия и трансфузиология. 1997. Т. 42. № 2. С. 10—15.

115

L

  1. Abdel-MageedA., Rosalio M.L. U., Hutcheson C.E. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential // Blood. 1997. Vol. 90. N 10. P. 32lb (4194).

  2. Hubl W., IturraspeJ., Hutcheson C.E. et al. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood // Blood. 1997. Vol. 90, N 10. P. 326b.

  3. MachalinskiB., PluciennikE., SamuelA.A. et al. A convenient and economical method for long distance shipment of non-frozen human mononuclear cord blood cells // Blood. 1997. Vol. 90. N10. P. 330b.

  4. Shlebak A.A., Marley S.B., Roberts LA. et al. Optimal timing for processing and cryopreservation of umbilical cord haematopoietic stem cells for clinical transplanta­tion // Bone Marrow Transplant. 1999. Vol. 23. N. 2. P. 131-136.

  5. Gluckman E., Broxmeyer H.E. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconis anemia by means of umbilical-cord blood from HLA-identical sibling // N. Engl. J. Med. 1989. Vol. 321. P. 1174-1178.

  6. Gluckman, E., Rocha, Y.,Boyer-Chammard,A. et al Outcome of cord-blood transplan­tation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the Euro­pean Blood and Marrow Transplantation Group // N Engl J Med. 1997. Vol. 337(6). P. 373-381.

  7. RubinsteinP., DobrilaL., Rosenfield R.E.,AdamsonJ. W. Processing and cryopreservation of placental/umbilical blood for unrelated bone marrow reconstitution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995. Vol. 92. P. 10119-10122.

  8. Newton L, Charbord P., Schaal J.P., Herve P. Toward cord blood banking: density-separation and cryopreservation of cord blood progenitors // Exp Hematol. 1993. Vol. 21(5). P. 671-674.

  9. Dennlng-KendallP., Donaldson C, NicolA. et al. Optimal processing of human umbili­cal cord blood for clinical banking // Exp Hematol. 1996. Vol. 24(12). P. 1394-1401.

  10. Гришина В.В., Тимохина Е.В., АндрееваЛ.Ю. Система сбора и фракционирования стволовых клеток пуповинной крови // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2004. Т. 3, № 6. С. 50—54.

  11. Regidor С, Posada M.,MonteagudoD. etal. Umbilical cord blood banking for unrelated transplantation: evaluation of cell separation and storage methods // Exp Hematol. 1999. Vol. 27(2). P. 380-385.

  12. YasutakeM.,SumitaM., TerashlmaS. etal. Stem cell collection filter system for human placental/umbilical cord blood processing//Vox Sang. 2001. Vol. 80(2). P. 101—105.

  13. EichlerH., Kern S., Beck С et al. Engraftment capacity of umbilical cord blood cells processed by either whole blood preparation and filtration // Stem Cells. 2003. Vol. 21. P. 208-216.

  14. Hoffman R., RozlerE., Chute J. et. al. Ex vivo expansion of human haemapoietic stem cells: implications for the modem blood bank //Vox Sang., 1998. Vol. 74. № 2. P. 259— 264.

  15. Hows J., Bradley B.A., Marsh J. Growth of human umbilical cord blood in long-term haematopoirtic cultures // LanceL, 1992. Vol. 340. P. 73—76.

  16. Huang S., Law P., Young D., HoA.D. Candidate haemapoietic stem cells from fetal tussues, umbilical cord blood vs adult bone marrow and mobilized peripheral blood // Exp. Haemalol., 1998. Vol. 26. № 12. P. 1162-1171.

  17. Huang S., Terstappen L.W. Formation of haemapoietic microenvironment and haemapoietic stem cells form singl human bone marrow stem cells // Nature, 1992. Vol. 360. P. 745.

116


  1. United States Patent 5,061,620, Tsukamoto, et al. Human hematopoietic stem cell.

  2. Руководство по подготовке стеклянной посуды для приготовления питательных сред, растворов, первичных и перевиваемых культур клеток для вирусологических исследований. Гвардейский: НИСХИ, 1985. 733 с.

  3. Юрасов СВ., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. и др. Выделение гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови человека для трансплантации // Гемато­логия и трансфузиология. 1997. Т. 42. № 2. С. 10—15.

  4. Abdel-MageedA., Rosalio M.L.U., Hutcheson C.E. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential // Blood. 1997. Vol. 90. N 10. P. 321b (4194).

  5. Hubl W., IturraspeJ., Hutcheson C.E. et al. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood // Blood. 1997. Vol. 90. N 10. P. 326b.

  6. Rqjendra N. Pahwa, Adiel Fleischer, Soe Than and Robert A. Goods // Successful hematopoietic reconstitution with transplantation of erythrocyte-depleted allogeneic human umbilical cord blood cells in a child with leukemia // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. Vol. 91. P. 4485-^1488. May 1994. Medical Sciences.

А. К. Джусипов, Ю. Д. Денисов, Е. А. Северова, Н. М. Поминова,

Е. Середа (НИИ кардиологии и внутренних болезней, лаборатория

экспериментальной кардиологии),

Е. А. Енин (ННЦХ им. А. Н. Сызганова, лаборатория патоморфологии),

Н. Н. Беляев, Г. К. Закирьянова, Т. А. Супниязова, Ю. В. Перфильева

(Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина

ЦБИ МОИ РК)

МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНФАРКТА МИОКАРДА И ЕГО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ

Высокие показатели заболеваемости и летальности при инфаркте миокарда (ИМ) определяют интерес ведущих научно-исследовательских учреждений во всем мире к проблеме профилактики и терапии этой патологии [1—4]. I Совершенно очевидно, что разработка принципов и способов профилактики и терапии ИМ невозможна без углубленного изучения его патогенеза. В связи с этим исследования, направленные на выявление причин и патогенетических механизмов развития ИМ, а также на поиск фармакологической коррекции этих механизмов, по-прежнему актуальны.

ИМ — многофакторное, "вероятностное" заболевание и в сложном комплексе сердечных, сосудистых и нейрогуморальных расстройств, I определяющих его возникновение и развитие, ключевая позиция отводится нарушению экстракардиальных факторов регуляции сердечной деятельности [5—7]. При развитии патологии сердца, в том числе и ИМ, изменения его I функционирования могут, с одной стороны, способствовать включению и/ или активации адаптивных реакций, повышающих резистентность миокарда к патогенным воздействиям, с другой — усугубить течение болезни [9, 10]. Поэтому, степень и масштаб повреждения сердца в значительной мере зависят от состояния экстракардиальных механизмов регуляции сердечной деятельности [8,12,13,14].

ИМ не одномоментный, а эволютивный, последовательный, многоэтапный процесс, поэтому при его изучении ученые настаивают на необходимости проведения серийных, динамических исследований [1,5,14,15,16].

Степень и характер повреждения сердца зависят от времени, прошедшего после окклюзии коронарной артерии у животных [17], и, как подтверждается многочисленными клиническими исследованиями, фактор времени во многом определяет эффективность лечения ИМ [ 1—3,5,19—23]. В большинстве случаев исследования динамики изменений регуляции функции сердца при экспери­ментальном ИМ проводились в течение двух часов или через 24 часа после коронаро-окклюзии [24,25]. Важность временного фактора в патогенезе ИМ подтверждается также и научными данными о том, что место возникновения, электрофизиологические механизмы и реакция нарушений ритма на антиаритмические препараты различны в зависимости от времени, прошедшего после окклюзии коронарной артерии [26].

118

Концепция регенеративной медицины, базирующаяся на использовании собственных стволовых клеток для восстановления поврежденных тканей, сосудов и органов, в последние годы привлекает внимание большого количества кардиологов. Данный метод является альтернативой многим известным методам лечения заболеваний сердца (медикаментозных, хирургических, вплоть до пересадки сердца). Однако многие критерии проведения клеточной терапии, ее показания и противопоказания при конкретной патологии все еще остаются на уровне интуитивных догадок, без серьезных экспериментальных и теоретических обоснований.

Следует отметить, что возможности клеточных технологий в кардиологии остаются малоизученными и нереализованными. Одной из причин этого является отсутствие ясности в представлениях о регенеративных возможностях миокарда [27].

Общепризнанной догмой считается, что во взрослом организме животных и человека КМЦ утрачивают способность к регенерации. В отличие от скелетной мускулатуры и гладкомышечных волокон, миокард не содержит стволовых или сателлитных клеток, способных к пролиферации и замещению образовавшегося дефекта. Вместо мышечной ткани при инфаркте миокарда активируется стромогенез и формируется рубец [28]. Иными словами, если возникает повреждение сердечной мышцы, то оно необратимо приводит к развитию кардиосклероза, а при обширном инфаркте миокарда—к нарушению его функциональных и биомеханических свойств, компенсаторной гипертро­фии, что часто заканчивается развитием СН в течение нескольких месяцев или лет [29,30].

Следует подчеркнуть, что фибробласты, принимающие участие в образовании рубца, являются производными мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Почему эти клетки, обладающие чрезвычайно широкими пластическими свойствами, не превращаются в кардиомиоциты — остается неясным, так как явных ограничений для их превращения в мышечные или сосудистые элементы нет. Можно предположить, как минимум, два варианта событий. Согласно одному из них, клетки-предшественницы фибробластов и эндотелия необратимо встали на путь терминальной дифференцировки и не могут образовывать иные типы клеток, а МСК не попадают в поврежденный миокард, так как не происходит их мобилизация из депо, в частности, костного мозга. Согласно другому сценарию, в поврежденном миокарде не формируются соответствующие условия для реализации пластических свойств МСК в направлении кардиомиогенеза.

Мнение о том, что в сердечной ткани отсутствуют клетки, способные к кардиомиогенезу, в последние годы пересматриваются. Данные последних лет свидетельствуют в пользу того, что в сердечной ткани сохраняются клеточные элементы, способные к пролиферации и образованию новых КМЦ. Так, в Работах коллектива авторов, представленных Л. В. Полежаевым (1965,1995), было показано, что в некротическом миокарде при введении биомодуляторов И ингибиторов его рубцевания на короткий срок появляются клетки, которые Можно морфологически идентифицировать как слабо дифференцированные ^Иобласты. Кроме того, под влиянием указанной терапии уменьшались

119

размеры новообразованной рубцовой ткани по сравнению с контролем. Однако происхождение "миобластоподобных клеток" осталось невыясненным: или это КМЦ, или они относились к другим мышечным элементам, например гладкомышечным клеткам, предшественники которых обнаруживаются в предсердиях. Полежаевым (2000) [34] было показано, что миокард кроликов обладает способностью к восстановлению своей структуры под действием гидролизата сердечной мышцы, гомогенатов скелетных мышц и других биопрепаратов. По-видимому, в данном случае индукция морфогенеза происходит под действием и-РНК, факторов роста мышечной ткани типа MyoD и т. п., которые способны вызывать мышечную экспрессию, в том числе и в фибробластах (Tam et al, 1995; Marry et al., 1996) Salvatore et al. (1995) показали, что, если фибробласты линии ЮТ 1/2 культивировать совместно с миобластами линии С 2 С 12 или скелетными миобластами, то они дифференцируются в мышечные трубочки (1—10% от всей популяции).

Как ранее было описано Румянцевым П. П. (1982) [31], КМЦ не могут пролиферировать, так как строго ориентированные агрегаты сократительных белков в КМЦ и наличие вставочных дисков создают препятствие для цитокинеза при митозе.

Именно поэтому для внедрения КМЦ в структуру миокарда необходимо индуцировать обратимую деструкцию (разборку) его миофибрилл, т. е. вызывать умеренную дедифференцировку сердечной ткани. По-видимому, из-за отсутствия условий для реализации этих процессов, в частности при инфаркте миокарда, митотическое деление в КМЦ обычно не идет дальше кардиокинеза, и регенерация заканчивается формированием полиплоидных КМЦ (Бродский, 1995) [32]. Кроме того, в ткани миокарда взрослого организма в обычных условиях не найдены структуры, подобные МСК, сателлитные клетки скелетных мышц, миобласты или незрелые кардиомиоциты, сохраняющие способность к делению. Обнаруженные в желудочках крыс популяции КМЦ (около 10%), обладающие способностью накапливать 3Н—тимидин, очевидно, можно отнести к клеткам, остановившимся на стадии кариорексиса с формированием полиплоидных (двухъядерных) клеток. Они, видимо, играют важную роль в адаптивной перестройке миокарда при его гипертрофии. Довольно редко можно наблюдать митозы КМЦ в периинфаркт-ной зоне, которые, как правило, заканчиваются цитокинезом. Они, как и цир­кулирующие МСК, не способны к репарации в полном объеме, восстановлению миокарда и инволюции рубца [31,33]. Согласно мнению Д. С. Саркисова [35], уменьшение размеров рубца, показанное в опытах Л. В. Полежаева (1965) [34], связано не с репаративной регенерацией, а с предотвращением вторичных волн некроза в миокарде. С позиций разработанной им теории внутриклеточной регенерации, сердце относится к органам, в которых при повреждении преобладают не пролиферативные процессы в паренхиме, а фибробластические реакции стромы, которые почти необратимы. Иными словами, следует считать, что дефицит функции КМЦ в миокарде возмещается не за счет пролиферации, а посредством внутриклеточных гиперпластических реакций [35].

Для понимания возможности стимуляции регенеративных процессов в КМЦ при ИМ следует проанализировать все механизмы, влияющие на

120

адаптационные и репарационные процессы. Анализ литературы и эксперимен­тальных данных позволяет предположить, что при инфаркте миокарда, как и при травмах, повреждениях кроветворной системы и стрессовых реакциях, в организме включается универсальный механизм адаптации, развивающийся по каскадоподобному механизму (КПМА) [36, 37]. КПМА — механизм взаимозависимой последовательной активации ключевых гомеостатических систем (нейроэндокринной, иммунной, ретикулоэндотелиальной (РЭС), кроветворной и др. систем), направленный на поддержание и восстановление постоянства внутренней среды организма в ответ на действие экстремальных, в том числе и повреждающих, факторов. Данная концепция базируется на учении Г. Селье, работах Ф. 3. Меерсона [42], П. К. Анохина [40], П. Д. Саркисова [35], К. В. Судакова [43] и других авторов.

Физиологической основой КПМА являются биоритмы (циркадные, суточные и др.). Каскадоподобный характер данного механизма заключается в том, что возбуждение от одной системы к другой передается последовательно по типу эстафеты с помощью специфических и неспецифических мессенджеров. Очень важной деталью является то, что КПМА может реализовываться по иерархическому типу. Например, стресс, анемия или повреждение тканей вызывают активацию нервной, затем эндокринной, Т-лимфоцитарной, РЭС, кроветворных систем. В результате этого происходит активация стромальных элементов, ответственных за формирование гемопоэтининдуцирующего микроокружения, усиливающая процессы пролиферации и деления стволовых клеток. В конечном итоге развиваются гиперплазия кроветворения, увеличение эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, циркулирующих СК в периферической крови, и повышение устойчивости организма к гипоксии, воспалению и разнообразным повреждениям (Дыгай, Шахов, 1989; Гольдберг и др., Дыгай и др., Шахов, 1991, 1996). При этом не исключается, что этот процесс может протекать и по сетевому принципу, т. е. одновременному развитию по нескольким направлениям. В частности, параллельно гипофи-зарно-гипоталамо-адреналовому пути стимуляция кроветворения может осу­ществляться с помощью симпатических, парасимпатических и адренергических механизмов, что позволяет более гибко реагировать на изменяющиеся условия жизнедеятельности.

Включение КПМА зависит от силы, характера и частоты действия экстре­мального фактора и исходного состояния, как всего организма, так и звеньев самого адаптационного механизма. Для каждого уровня КПМА существует свой специфический регулятор. Так, для передней доли гипофиза кортико-либерина в передней доле гипофиза вырабатывается АКТГ. Он, в свою очередь, стимулирует выработку глюкокортикоидов в надпочечниках. Глюко-Кортикоиды вызывают миграцию Т-лимфоцитов из тимуса. Т-клетки Срабатывают колониестимулирующие факторы, ИЛ-3 и другие факторы, активирующие миелогенез, стромогенез и клетки РЭС. Каждый уровень КПМА Работает по принципу функциональной системы (Анохин, 1975) [40], которая °существляет восприятие и переработку идущей к ней специфической и ^специфической информации, с последующей интегральной оценкой и ПеРедачей ее к следующему звену КПМА. Блокада любого уровня КПМА при

121

прохождении через него специфического сигнала приводит к супрессии, деформации или полной отмене адекватного реагирования. Так, удаление надпочечников, тимуса или блокада РЭС или Т-клеток с помощью антител полностью отменяет стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток, отвечающих за перенос гемопоэтиндуцирующего микроокружения КОЕФ (Шахов, 1991). Коррекция вышеуказанных повреждений, в частности за счет введения тимоцитов, восстанавливает эти повреждения [39]. Специфические сигналы определяют общий вектор развития КПМА.

Неспецифические регуляторы переводят отдельные звенья КПМА в режим ожидания (включения/ выключения) и создают общую его гармонику. Специфические регуляторы могут стать неспецифическими, если будут действовать не адресно, т.е. на свою специфическую мишень. Таковым стано­вится АКТГ, если действует не на Т-клетки, а на фагоцитирующие мононук-леары [41]. Вместе специфические и неспецифические регуляторные механизмы создают единую "голографическую" картину работы КПМА с учетом реального времени и перспективы его развития, позволяющую объединить многочисленные гомеостатические реакции в единую функциональную гиперсистему. Если инициация КПМА обычно не превышает одни сутки, то I его развитие и реализация занимают от двух недель (гемопоэз) до нескольких месяцев (костная ткань) [37,39].

Анализ имеющейся информации, в том числе и экспериментальных данных, позволяет предположить, что развитие острого инфаркта миокарда также происходит по сценарию развития КПМА. Так, после ишемии, некроза миокарда, сопровождающегося выраженным болевым синдромом, происходит активация нервной, гипофизоадреналовой, иммунной и ретикулоэндотелиаль-ной систем [42, 43]. В поврежденную ткань устремляются нейтрофилы, моноциты и лимфоциты [28]. В результате в миокарде изменяется микроокру­жение. Очевидно, именно в этот период происходит выработка разнообразных ростовых и дифференцирующих факторов, готовых включить механизмы локальной регенерации в поврежденном миокарде. Однако ввиду того, что в сердечной мышце нет КМЦ или МСК, способных дифференцироваться в кардиомиоциты, вместо кардиомиогенеза происходит активация стромальных и сосудистых клеток, которые присутствуют в интерстициальном слое между мышечными волокнами и около сосудов. Если циркулирующие МСК мигрируют в сердце, то по каким причинам они не могут реализовать свою репарационную миссию? С одной стороны, это может происходить из-за их недостаточного количества, а с другой стороны — нельзя исключить и того, что они не подготовлены к дифференцировке в направлении миогенеза. Кроме того, нельзя исключить, что микроокружение и биомеханика поврежденного миокарда не создают необходимых условий для развития МСК в кардиомио­циты. Однако последний довод опровергается в опытах, когда МСК трансплантируют в сердечную ткань.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что при инфаркте миокарда может происходить развитие КПМА. В то же время, в силу особенностей формирования сердца, терминальной дифференцировки КМЦ и отсутствия в них соответствующих стволовых клеток, вместо

122

включения механизмов репаративной регенерации включается регенерация на уровне гипертрофии миокарда и возникновения полиплоидных, с повы­шенной функциональной активностью, клеток. Параллельно образующийся дефект необратимо замещается рубцовой тканью, что может привести к развитию разнообразных осложнений, включая и сердечную недостаточность.

Теоретически изменить ход необратимых изменений в сердечной ткани при инфаркте миокарда можно, если в каскадоподобный механизм адаптации включить экзогенные МСК, обладающие миогенным и ангиогенным потен­циалом. Тогда вместо кардиосклероза, образования рубцов и развития сердеч­ной недостаточности будет включен механизм репаративной регенерации и восстановления миокарда. Этот вопрос достаточно освещен в обзоре И. В. По­тапова и др. (2001) [27]. Отмечено, что для активного участия пересаженных клеток в систоле левого желудочка (ЛЖ) должны выполняться несколько условий:

— клетки должны обладать способностью дифференцироваться в кардиомиоциты, содержать сократительные структуры;

—между клетками должны присутствовать вставочные диски с щелевыми контактами для проведения потенциалов возбуждения к пересаженным клеткам от КМЦ хозяина;

—должна отсутствовать реакция отторжения;

—необходимо свести до минимума ишемические повреждения, шок, некроз и апоптоз пересаженных клеток;

—пересаженные клетки должны способствовать репарации поврежденного участка (замещение соединительной ткани, формирование полноценной биомеханической архитектоники сердечной ткани).

Большинству перечисленных критериев соответствуют мезенхимальные стволовые клетки. Работы по управлению их дифференциации в кардиомио­циты продолжаются. Так, S. Makino et al. (1999) [44] получили кардиомиогенную клеточную линию из мышиных клеток стромы костного мозга, в которых после соответствующей обработки были индуцированы дифференцировки в КМЦ. Эффективность обработки составила 30%. Полученные клетки экспресси-ровали множество специфических для КМЦ генов, имели фенотип фетальных желудочковых КМЦ. Дифференцированные таким образом КМЦ были связаны между собой вставочными дисками, формировали мышечные трубочки, спонтанно сокращались, имели КМЦ-подобную ультраструктуру, включая типичные сакромеры, центрально расположенное ядро, множествен­ные гранулы гликогена и митохондрии. Мышечные трубочки генерировали потенциалы действия, напоминающие таковые у желудочковых КМЦ. Подобные результаты получены S. Tomita et al. (1999) [45], которые свиде­тельствовали о повреждении миокарда с помощью жидкого азота. Кроме того, было установлено, что КМС наряду с образованием КМЦ формировали эндотелиальные и гладкомышечные клетки, что улучшало функцию сердца (Шумаковидр., 2003; Davini etal., 2003).

Не имея полной теории механизма ремодулирующего действия трансплан­тированных клеток, многие авторы сходятся в том, что в результате проведен­ной клеточной кардиопластики можно достичь следующих эффектов:

123

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


Учебный материал
© bib.convdocs.org
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации