Алиев. Современные клеточные технологии в медицине - файл n1.doc

Алиев. Современные клеточные технологии в медицине
скачать (1468 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc1468kb.21.10.2012 09:57скачать

n1.doc

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
\{

  1. предупреждения развития постинфарктной аневризмы;

  2. ускорения процессов регенерации миокарда;

  3. предотвращения распространения очага некроза и рубцовой ткани;

  4. улучшения диастолических свойств миокарда и нагнетательной функции сердца;

  5. стимуляции процессов ангиогенеза и оксигенации миокарда.

Т. Wang et al. (2000) выдвинули гипотезу, что микроокружение в миокарде создает определенные условия и сигналы для кардиомиогенной дифферен-цировки МСК. В их исследованиях крысиные МСК после культивирования и удаления большинства гемопоэтических стволовых клеток были пересажены в миокард и дифференцировались в КМЦ, образовывали щелевые контакты. С другой стороны, в опытах на крысах с использованием DAPI МСК и моно-нуклеаров костного мозга было установлено, что стволовые, но не мононук-леарные элементы встраиваются в сердечную ткань после коронароокклюзии. При этом через два месяца они образовывали компактные клеточные агрегаты в миокарде, которые не были тесно связаны с окружающими клетками синцития. Интересно, что в обычных условиях МСК утрачивали способность включаться в процессы клеточной репарации миокарда (Zu et al., 2004), что косвенно свидетельствует об индукции кардиомиогенеза в сердечной ткани только при экстремальных состояниях. МСК взаимодействуют с КМЦ в сердце через С43- и С40- области межклеточных контактов с образованием симметричных гемопоэтических и асимметричных (гетеротипических, гетеромерных) каналов с переходной проводимостью. Клеточная трансплан­тация фетальных КМЦ, меченых геном белка с зеленой флюоресценцией, в сердце показала, что они способны формировать функциональный синцитий, встраиваясь в поврежденный миокард животных (Rubart et al., 2003). Однако данные о том, что МСК обладают такой способностью, крайне противоречивы, и часто непонятно, является ли улучшение работы сердца результатом процессов образования и интеграции новых КМЦ, или они развиваются в результате стимуляции ангиогенеза и гипертрофии миокарда.

Наряду с кроветворными и мезенхимальными стволовыми клетками в костном мозге присутствуют и другие элементы, способные играть активную роль в ремоделировании инфаркта миокарда, в частности речь идет о клетках-предшественниках эндотелиального ряда. Они способны при попадании в поврежденный миокард формировать новые сосуды и капилляры, улучшая оксигенацию ткани. В этой связи рассматривается вопрос о целесообразности применения гетерогенной популяции клеток костного мозга, способной патогенетически воздействовать на различные механизмы репарации КМЦ и влиять на рубцовую ткань. Кроме того, МСК и вспомогательные клетки (типа эндотелиальных, макрофагов, лимфоцитов, стромальных клеток) способны секретировать многочисленные цитокины, ростовые факторы и создавать необходимое микроокружение для прогениторных клеток (Orlic et al., 2001)-По сравнению с ЭСК мезенхимальные стволовые клетки имеют ряД преимуществ.

124

j

МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Экспериментальное моделирование острого инфаркта миокарда в сочетании с современными и классическими исследованиями крайне необходимо для понимания патогенетических механизмов развития данного заболевания у людей и разработки новых способов лечения.

МЕТОДЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИНФАРКТА

МИОКАРДА

Обычно для моделирования острого инфаркта миокарда (ОИМ) используются крысы обоего пола породы "вистар", весом 180—220 г. Моделирование проводят в асептических условиях с применением всех правил септики и антисептики. Перед коронароокклюзией животных исследовали функциональное состояние сердца. Далее при моделировании эксперимен­тального инфаркта миокарда данную процедуру повторяли.

Для выбора наиболее адекватного метода экспериментального инфаркта миокарда мы изучили следующие модели:

1-й метод — модель экспериментального инфаркта миокарда по методу Н. Selye (окклюзия верхней левой венечной артерии). Проведенные исследования показали, что у всех животных через 24 ч после наложения лигатуры наблюдались обширные трансмуральные инфаркты в стенке левого желудочка, подтвержденные гистологическими исследованиями. Несовершен­ством модели является: 30—40%-ная смертность влечение первых 24 ч из-за высокой травматичности (перерезка ребер грудной клетки и мышц, высокая частота развития пневмоторакса).

2-й метод — модель экспериментального инфаркта по методу Н. Selye в модификации Н. М. Поминовой и С. С. Дюсенова (окклюзия верхней левой венечной артерии) [24]. У животных развивался крупноочаговый ИМ (переднебоковой ИМ или ИМ верхнего отдела боковой стенки левого желудочка), подтвержденный гистологическими исследованиями. Недостатки модели: окклюзия вызывается перевязкой артерии, а лигатура не может быть подвергнута тромболизису. К достоинствам модели относятся низкая травматичность и смертность.

3-й метод — моделирование коронарной недостаточности в результате стрессорного повреждения. Методом стрессорного воздействия в нашем исследовании являлась длительная иммобилизация животных в положении на спине по Ф. 3. Меерсону. Лишение возможности свободно передвигаться является для животного сильнейшим стрессирующим фактором. Продолжи­тельность воздействия составляла 6 ч ежедневно в течение 14 дней. На 15-й День у животных регистрировали мелкоочаговые некрозы сердечной мышцы, У 10% животных диагностировали ИМ различной локализации. Развитие заболевания при данной модели сопровождается всеми клиническими, электрофизиологическими и биохимическими изменениями, свойственными стенокардии. Функциональные исследования показывают, что эксперимен­тальная модель наиболее соответствует стенокардии нестабильного течения.

4-й метод — изадриновое повреждение миокарда. Одним из основных

125

факторов, повреждающих миокард при стрессе, является выброс избыточных количеств катехоламинов, которые способны вызывать дистрофические ц некробиотические изменения кардиомиоцитов. Мы моделировали данные повреждения с помощью подкожного введения субтоксических доз (40 мг/кг) изопротеренола (изадрина), как наиболее эффективного синтетического производного катехоламинов длительного действия. Избыток катехоламинов в миокарде обусловливает развитие их кардиотоксических эффектов. В миокар­де у подопытных животных отмечалось формирование небольших участков некроза миокарда с последующим развитием мелкоочагового кардиосклероза. В целом изадриновое повреждение соответствует (с определенным приближе­нием) вариантной стенокардии (стенокардия принцметала).

Обе модели (стрессовая и изадриновая) достаточно схожи по своим морфофункциональным проявлениям. Но стрессовое повреждение по этиологии и патогенезу более приближено к клиническим проявлениям коронарной недостаточности (мелкоочаговый ИМ).

ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА

После проведения коронароокклюзии в нижней трети передней левожелу-дочковой коронарной артерии или в ином месте (в зависимости от модели экспериментального инфаркта—см. ниже) были проведены как наблюдения за состоянием животного, так и патоморфологические исследования миокарда.

Итак, через 24 ч моделирования ОИМ в зоне ишемии наблюдаются все признаки, характерные для стадии альтерации при наблюдаемой воспали­тельной реакции, сопровождающиеся отеком и набуханием кардиомиоцитов (КМЦ), появлением дистрофических и дегенеративных признаков. КМЦ начинают терять свою поперечную исчерченность. Четких границ зоны некроза в этот период выявить не удалось. В интерстициальной соединительной ткани и между мышечными волокнами появляются клеточные инфильтраты, содержащие нейтрофилы, моноциты и лимфоциты. Выраженность некроти­ческих нарушений во многом зависела от степени развития изменений в гемоди­намике. В тех участках, где они были более выражены, наблюдался и более обширный некроз мышечных волокон. Нарушение со стороны сосудов и микро-циркуляции сопровождались появлением отека, стаза клеток крови, кровоиз­лияний и лейкоцитарной инфильтрации. Все эти нарушения в миокарде соответствуют тем данным, которые наблюдали при аналогичных ситуациях и другие авторы [179—182].

К 3—7-м суткам уже можно более серьезно говорить о площади инфаркта, так как начинают проявляться четкие границы некроза (см. приложение 1). В перииифарктной зоне все еще наблюдаются скопления лейкоцитов, хотя их количество начинает снижаться. Капилляры вокруг поврежденных КМЦ часто остаются тромбированными или разрушаются. Мышечные клетки начинают подвергаться резорбции, очевидно за счет фагоцитоза и выделения лизосоиальных ферментов [183]. В патологический процесс включаются ткани, расположенные в верхней и средней стенках левого желудочка. В миокарДе появляются недифференцированные мезенхимальные клетки со стромальныя фенотипом. Следует подчеркнуть, что пролиферативная реакция со стороны

126

соединительной ткани возникает именно в тот период, когда вместо гранулоцитов в миокарде начинают преобладать мононуклеарные клетки (моноциты, макрофаги, лимфоциты), что наблюдали и другие авторы [184].

На 10— 14-е сутки наблюдений в перииифарктной зоне обнаруживаются гетерогенные по своему составу КМЦ. Часть из них несет признаки атрофии— внутриклеточного некроза и лизиса органелл. Фибробласты активно продуцируют коллаген. Между зоной инфаркта и мышечной тканью прослеживается достаточно четкая граница.

На 30-е сутки в миокарде подопытных животных наблюдается развитие рубцовой ткани, занимающей 60—70% от площади левого желудочка и сочетающейся с гипертрофией сердца на 230—240% от исходного уровня. Исследование функциональных свойств миокарда показало, что изменения со стороны ЭКГ выявляются только у части животных в первые сутки опыта в виде нарушений ритма, появляются экстрасистолии, изменяются в зубце QRS.

Измерение порога фибрилляции желудочков показало, что он снижается на 30—40% по сравнению с контролем.

АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Наиболее адекватной моделью ОИМ для имплантации стволовых клеток была признана модель Н. Selye в модификации Н. М. Поминовой и С. С. Дюсенова (см. метод 2), так как он наименее травматичен, и выживаемость крыс наибольшая при стабильно и ярко протекающем процессе.

Контролем развития ОИМ у крыс служили следующие показатели: изменения в динамике электрофизиологических показателей сердца, ультразвуковое исследование сердца в динамике ОИМ, патоморфологические изменения в ткани миокарда.

ИЗУЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

Перед проведением ЭКГ животным давался легкий эфирный наркоз. Исследование проводились в 1-м, 2-м, 3-м AVR, AVL и AVF отведениях.

Исследование показало, что выявляются только у части животных в первые сутки опыта в виде нарушений ритма, появления экстрасистолии, проявлением патологического зубца Q, иногда комплекса QS. Также выявлена элевация сегмента PS — Т. Чаще всего диагностируется переднебоковой распростра­ненный передний инфаркт миокарда.

Спустя две недели не было обнаружено каких-либо отклонений в ЭКГ по сравнению со здоровыми животными.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МИОКАРДА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

Исследование патоморфологических характеристик производится на трех Уровнях: макроскопический анализ — внешнее обследование органов; микроскопическое исследование тканей и электронно-микроскопическое изучение клеток.

127

Макроскопически сердца крыс средних размеров, реже — чуть больще среднего, плотной консистенции (в единичных случаях наблюдался эффект "каменного сердца"). Поверхность сердца неровная, бугристая, темно-бурого цвета. Часто не представлялось возможным выделить орган из сердечной сумки все ткани представляли собой единый конгломерат. На темно-буром фоне выделялись хорошо заметные участки ишемии белесоватого цвета. На разрезе так же обнаруживались четкие очаги патологических процессов миокарда. В суженных просветах имелись довольно плотные кровяные свертки.

II

V

л!

Макроскопически сердце крысы (группа ИМ). На разрезе четко просматривается зона нарушения кровообращения. Стрелочками отмечены зоны ишемии миокарда.

128

Так же отмечено, что при вскрытии грудной клетки и плевральной полости имело место большое количество серозно-геморрагической жидкости.

Гистологическое исследование

Материал для гистологического исследования фиксировали в 10% забу-ференном формалине, для электронно-микроскопического исследования — 2,5%-ном растворе глютаральдегида. Проводка осуществлялась по общепри­нятой гистологической и электронно-микроскопической методикам. Гисто­логические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, полутонкие срезы—метиленовым синим, азуром-2 и основным фуксином (С. Humphray, F. Pittman, 1974). Препараты исследовали на световом микроскопе "Leica" DM 4000 В с цифровой камерой "Leica" DFC 320. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали на электронном микроскопе ЭВМ- 100Л.

Исследования показали, что при моделировании экспериментального инфаркта миокарда в ткани сердца отмечаются мелкие очаги повреждения миокарда, характеризующиеся глыбчатым распадом миофибрилл и миолизом. В мышечных волокнах зоны ишемии при отмечается исчезновение гликогена, резкое снижение окислительно-восстановительных ферментов.

Интерстициальное пространство зоны ишемии содержит серозную жидкость, белковоподобное вещество, фибрин, эритроциты, макрофаги и нейтрофильные лейкоциты. Последние интактны или разрушены и находятся в непосредственной близости к необратимо поврежденным кардиомиоцитам.

Нарушения гемодинамики локализуются в основном в зоне ишемии миокарда и вокруг нее. Сосудистые расстройства развиваются преиму­щественно в зоне ишемии: гиперемия, отек, кровоизлияния, стазы, лейкоцитарная инфильтрация, микротромбы (рис. 1).

В миокарде обнаруживаются множественные очаги пролиферации соединительнотканных элементов вокруг погибших групп мышечных волокон. Пролиферативно-клеточная реакция вокруг участков некроза миокарда начиналась с появлением мононуклеаров, постепенно вытесняющих лейкоциты. Кроме лейкоцитов и гистиоцитов, среди пролиферирующих клеток наблюдались макрофаги, фибробласты, единичные лимфоидные клетки. В мышечных волокнах субэпикардиального слоя левого желудочка выявлено много мелких эозинофильных участков, лишенных ядер. В некоторых эозинофильных сегментах ядра сохранялись. Наряду с эозинофильными встречаются и базифильные мышечные волокна. Ядра в них — с явлениями пикноза, рексиса и лизиса. Гликоген в зоне ишемии отсутствовал.

В отдельных приготовленных гистологических срезах выявлены участки формирования абсцессов непосредственно в ткани сердца животных. Рядом также имели место зоны ишемии миокарда, с выраженными дистрофическими процессами в кардиомиоцитах.

Нарушения гемодинамики локализовались в основном в зоне ишемии Миокарда и вокруг нее. Они более интенсивны по сравнению с ранними сроками и проявлялись в венозной гиперемии, периваскулярном отеке, мелкоочаговых, сливающихся кровоизлияниях, миграции лейкоцитов в интерстициальную ткань. Лейкоцитарная реакция более заметна, чем в ранние сроки.

129

A

Б

Рис. 1. Зона инфаркта: А — отек стромы, лимфощщая инфильтрация. Ув. х 100. Б — дистрофические изменения кардиомиоцитов Ув. х 400.

130

Рис. 2. Паретически расширенные сосуды, заполненные склеенными эритрэоцитами (микротромбы). Прилежащая сердечная ткань отечна, немного разволокненаа. Окраска гематоксилин — эозин. Ув. х 200.

Кровоизлияния встречались чаще во внутренних слоях стенкси левого желудочка сердца. Мышечные структуры в центральной зоне развивающегося инфаркта подвергались деструкции, фрагментации и лизису. При изучении околоинфарктной зоны миокарда отмечено, что в миокарде формируется зона липидной инфильтрации, расположенная за пределами зоны ишемищ (жировая дистрофия кардиомиоцитов вследствие гипоксии).

Зона инфаркта миокарда выявляется при микроскопии. ВЗыявлены эозинофилия, комковатость саркоплазмы, некробиотические измешения ядер в поврежденных кардиомиоцитах, стазы в капиллярах, выход фсорменных элементов крови за пределы капилляров, глыбчатый распад миофийрилл.

В краевой зоне ишемического некроза миокарда выявляется нерегулярное чередование кардиомиоцитов, подвергшихся коагуляционному мекрозу и кардиомиоцитов с разной степенью выраженности дистрофши (рис.2). Коагуляционный некроз кардиомиоцитов проявляется пикно:зом ядер, очаговой деструкцией и контрактурой фрагментов миофибрилл, вшутрикле-точным отложением фибрина. В целом, морфологические изменения кардио­миоцитов в краевой зоне ишемии свидетельствуют о прогрессировшном рас­пространении некроза вследствие гипоксии и очаговой аноксии, обусловленной микротромбозом капилляров по периферии зоны ишемии (рис. 3).

131

Рис. 3. Инфаркт субэндокардиальный, стадия организации. Клеточная инфильтрация представлена круглоклеточными элементами. В прилежащих кардиомиоцитах отмечают­ся изменения соотношения ядерного цитоплазматического индекса в сторону ядра. Окраска гематоксилин — эозин. Ув. х 200.

ВЫВОДЫ

1. При моделировании острого инфаркта методом коронаро-окклюзии можно воспроизвести картину ИМ, наблюдаемого у человека, с развитием характерных для данного заболевания морфофункциональных изменений.

2 На данный момент наиболее удобной и эффективной моделью экспери­ментального инфаркта миокарда для последующего введения СК признана модель крупноочагового инфаркта миокарда по Н. Selye в нашей модификации.

3. Моделирование инфаркта миокарда окклюзией коронарной артерии укладывается в классические сроки, описанные в литературе и совпадает с клиническими данными.

ПОЛУЧЕНИЕ ОБОГАЩЕННЫХ ФРАКЦИЙ ГСК/ПК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА

КРЫС МЕТОДОМ ИЗОПИКНИЧЕСКОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ НА

ГРАДИЕНТАХ ПЕРКОЛА

В настоящее время для получения ГСК из костного мозга обычно используют метод выделения фракции мононуклеарных клеток с помощью центрифугирования суспензии клеток костного мозга (ККМ) на градиенте плотности (1,076 г/мл), в качестве которого используют смесь фикол-верографин. В Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айт-хожина был разработан метод разделения ККМ мышей на сложном многоступенчатом градиенте перкола, в результате которого получают три фракции с плавучими плотностями 1,08,1,09,1,095 г/мл, каждая из которых содержит до 73% клеток с фенотипом ГСК/ПК CD34+ (см. гл. Н. Н. Беляевав настоящей монографии). Такой высокий процент ГСК/ПК, по нашему мнению, 132

должен обеспечить более эффективную регенерационную активность вводимых клеток. Кроме того, в вышеназванных фракциях отсутствуют клетки со зрелым фенотипом, такие как Т-, В-лимфоциты, а также моноциты/макро­фаги. Этот факт также предполагает более высокую эффективность исполь­зования клеток костного мозга.

Хотя крысы, как и мыши, относятся к семейству грызунов, необходимо было убедиться, что разработанные ранее приемы выделения обогащенных фракций ГСК/ПК из ККМ мышей пригодны для крыс.

Мы провели выделение трех фракций ККМ и оценили их культуральные и функциональные свойства. В частности изучили продукцию данными фракциями супрессорных факторов под действием цитокинов, наличие которых является атрибутом ГСК/ПК. С этой целью суспензию ККМ получали, промывая бедренные и берцовые кости, затем разделяя ККМ на 5-ступенчатом градиенте плотности перкола со следующими плотностями: 1,100; 1,090; 1,076; 1,060; 1,033 г/мл.

Подсчет клеток в каждой фракции показал следующее распределение в процентах (табл. 1).

Таблица 1

Процентное содержание ядерных клеток, неокрашенных трипановым синим в изопикнических фракциях ККМ крыс

Плавучая плотность клеток, г/мл Содержание клеток, %

1,033 2,2

1,060 3,2

1,076 79,5

1,090 10,9

1,1 2,1

дно пробирки 2Д

Как видно из таблицы 1, наибольшее количество клеток содержалось во фракциях 1,076 и 1,090.

Затем фракцию 1,090 отмывали от примеси перкола и ресуспендировали в культуральной среде. Согласно методу фракционирования ГСК мышей эту фракцию разделяли еще раз на дополнительном двухступенчатом градиенте перкола, получая 3 фракции: Фр. 1 — 1,080 г/мл, Фр. 2 — 1,090 г/мл, Фр. 3 — 1,095 г/мл. Эти фракции стимулировали различными индукторами (Фр. 1—Ш-2, гистамином, АФП, Фр. 2 — IL-3, АФП, ФР. 3 — IL-2, АФП) в течение трех часов, а затем культивировали в течение 48 ч в отсутствии индукторов. О супрессорной активности супернатантов судили по способности подавлять рост клеток миеломы PAI в условиях ex vivo. Результаты эксперимента представлены на таблице 2.

Как видно из таблицы 2, в отсутствие индуктора исследуемые изопикни-Ческие фракции практически не секретировали факторы с супрессорной активностью. Альфа-фетопротеин вызывал наибольшую индукцию супрес­сорной активности во всех фракциях. Фр. 1 кроме того индуцировалась IL-2 и

133

Таблица 2 Продукция супрессорных факторов различными культивируемыми фракциями ККМ

крыс

Фракция Индукторы супрессорной активности (ИС, %)

ККМ без АФП IL-2 IL-3 Гистамин

индуктора

Фр. 1 8,6±1,3 41,9±1,0 24,8±1,4 - 24,4±1,6

Фр. 2 5,8±1,5 38,б±0,9 26,4±0,7

Фр. 3 6,0±1,8 43,4±1,2 31,3±1,0

гистамином, Фр. 2 — только IL-3, а Фр. 3—только IL-2. Полученные данные полностью совпадают с результатами исследования супрессорной активности идентичных изопикнических фракций ККМ мышей (см. гл. Н. Н. Беляева в настоящей монографии). Из этого сопоставления следует, что изопикнические фракции ККМ (1,08,1,09,1,095 г/мл) крыс идентичны фракциям ККМ мышей и, следовательно, относятся к CD34+ клеткам, поэтому могут быть использованы в качестве источника ГСК/ПК для регенерационной терапии. Далее необходимо было разработать более упрощенную методику выде­ления необходимых фракций из суспензии ККМ, сократив расход дорогостоя­щего перкола, и оптимизировать количество циклов центрифугирования клеток. Для этого суспензию ККМ наслаивали на трехступенчатый градиент перкола со следующими ступеньками: 1,09, 1,076, 1,06 г/мл. В результате выделились три фракции в соответствующих интерфазах и четвертая фракция, содержащая большое количество эритроцитов на дне пробирки. Фракцию 1,09 дополнительно разделяли на двухступенчатом градиенте (1,09 и 1,08) на три фракции, третья из которых занимала положение, соответствующее плотности приблизительно 1,095. Эта фракция была малочисленная и загрязнена эритроцитами, поэтому в дальнейших экспериментах ее отбрасывали. В остав­шихся двух фракциях клетки составляли 33 и 67 % соответственно. Клетки с плавучими плотностями 1,076,1,08 и 1,09 г/мл были использованы для введе­ния в сердечную мышцу.

ОТРАБОТКА РЕЖИМА ВВЕДЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Способ введения ГСК/ПК является существенным моментом успеха проведения клеточной терапии. Поэтому мы провели специальные исследо­вания по отработке способа и режима введения суспензии ГСК/ПК при моделировании ИМ. Были использованы три режима введения клеток в сердце. Клетки вводили в количестве ЗхЮ5 в объеме 100 мкл в одну точку рядом с наложенной лигатурой.

  1. Введение клеток сразу после окклюзии коронарной артерии.

  2. Введение клеток в сердце через 24 ч после окклюзии коронарной артерии с повторной торакотомией и выведением сердца из грудной полости.

  3. Введение клеток в сердце через 38—40 ч после окклюзии коронарной артерии с повторной торакотомией и выведением сердца из грудной полости-

134

Кроме того, при первом и третьем режимах вводили культуральную среду в том же объеме, что и суспензию клеток. На таблице 3 представлены данные по летальности в различных группах животных, которым вводили клетки.

Наименьшую летальность (10%) регистрировали при первом режиме введения суспензии ГСК/ПК.

Как видно из таблицы 3, летальность после введения суспензии ГСК/ПК в течение первых двух часов при втором режиме введения составила 55%, в последующие сутки в живых осталось только 11% животных.

Таблица 3 Количество животных, использованных для отработки режима введения 1СК

Режим введения ГСК Общее Количество % от общего

количество выживших числа

кыс крыс животных

Сразу после окклюзии 40 __-—- —

Через 24 ч 55 _Jj п __

Через 38^0 ч 50 __^ 50 __

Введение культуральной среды:

сразу после окклюзии 10 °"

через 38—40 ч | 15 | __?! I 53 _

При третьем режиме дозирования после введения суспензии ГСК/ПК летальность составила 20%, а в течение первых суток пало еще 30% животных.

Летальность после введения культуральной среды существенно не отличалась в группах с аналогичным режимом введения ГСК/ПК. Из этого следует, что высокая смертность была связана с травматичностью операции, а не токсическим эффектом ГСК/ПК. Поэтому низкая летальность при первом режиме введения объясняется минимальным травматическим воздействием на животное.

В связи с высокой летальностью при 2-м и 3-м режимах введения клеток мы решили использовать 1-й режим, т. е. введение суспензии ГСК/ПК сразу после перевязки венечной артерии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ВВЕДЕНИЯ ГСК/ПК В СЕРДЕЧНУЮ МЫШЦУ ПРИ ОИМ

Среди оставшихся в живых животных с введением ГСК/ПК после наркоза летальность составила к 21-му дню наблюдения: с введением фракции 1,076 г/мл (1-я группа) - 20%; с введением фракции 1,080 г/мл (2-я группа) -30%; с введением фракции 0,090 г/мл (3-я фракция) — 5 %.

В дальнейшем, животным с ИМ после введения трех фракций СК в двух режимах дозирования на 7-й, 14-й и 21-й дни после окклюзии проводили электрокардиографическое обследование. Исследование проводили у наркотизированных кетамином животных.

Всего получено 53 эхографических рисунка левого желудочка, аорты, меж­желудочковой перегородки и данных о функциональной активности миокарда. У животных был проведен макроскопический анализ и взяты органы для гисто­логического исследования (сердце, печень, селезенка, почки, надпочечники).

135

Гистологический анализ тканей сердца в трех различных группах, проведенный на 21-й день после окклюзии и введения клеток, показал следующие особенности.

1-я группа (фракция 1,076).

Среди кардиомиоцитов определяются скопления сосудов капиллярного типа, заполненных кровью, между которыми разрастается соединительная ткань. Наблюдается разрастание соединительной ткани между мышечными волокнами. В отдельных кардиомиоцитах определяется паренхиматозная дистрофия. В некоторых зонах вокруг сосудов наблюдается избыточное количество соединительной ткани. Прилежащие кардиомиоциты фрагмен-тированы, поперечная исчерченность сохранена. К очагу инфаркта миокарда прилежат кардиомиоциты с сохраненной поперечной исчерченностью. Инфильтрация круглоклеточная, слабо выраженная, представлена в основном фибробластами, располагающимися межмышечно, немного оттесняя волокна кардиомиоцитов. В очаге организовавшегося инфаркта отмечается разрастание грубо-волокнистой соединительной ткани. В прилежащей ткани сердечной мышцы между кардиомиоцитами отмечается образование нежных соедини­тельнотканных волокон, с очаговой воспалительно-клеточной инфильтрацией. Дальше от очага инфаркта вновь образованная соединительная ткань отсутствует.

2-я группа (фракция 1,080 г/мл).

На срезах наблюдается большое количество мелкого и крупного калибра сосудов, заполненных кровью, фокусы слабо выраженного межмышечного отека, кардиомиоциты сохраняют поперечную исчерченность, ядра четкие. Цитоплазма на отдельных участках имеет разную оптическую плотность. Очаговое разрастание соединительной ткани слабо выраженное. Отличаются выраженный полиморфизм мезотелиальных клеток висцерального листка эпикарда, большое количество тонкостенных сосудов капиллярного типа. В прилежащей ткани наблюдается слабо выраженный отек. Под эпикардом отмечаются очаги разволокнения сердечной ткани. Умеренно выраженная инфильтрация представлена круглоклеточными элементами с примесью полиморфно-ядерных лейкоцитов. На отдельных препаратах встречаются фо­кусы с деформированными кардиомиоцитами с нечеткими контурами ци-топлазматической мембраны, участками разрастания соединительной ткани и межмышечным отеком. Таким образом, зона инфаркта миокарда представле­на тонкостенными сосудами и умеренно выраженной воспалительной кругло-клеточной инфильтрацией с примесью полиморфноядерных лейкоцитов. 3-я группа (фракция 1,090 г/мл).

У животных из данной группы регистрируется инфаркт субэндокар-диальный в стадии организации. Клеточная инфильтрация представлена круглоклеточными элементами. В прилежащих кардиомиоцитах отмечаются изменения соотношения ядерного цитоплазматического индекса в сторону ядра. Стенки коронарных сосудов с умеренным разволокнением заполнены склеенными эритроцитами. Наблюдается умеренно выраженный мышечный отек с примесью фиброцитов и с формированием нежных соединительно­тканных волокон, очаговые межмышечные кровоизлияния, полнокровие

136

сосудов. Поперечная исчерченность кардиомиоцитов сохранена. Большинство сосудов паретически расширены, заполнены склеенными эритроцитами (микротромбы). Таким образом, при исследовании миокарда после введения фракции 1,09 отмечаются изменения сердечной мышцы, характерные для более позднего срока инфаркта миокарда (20—25 дней), по сравнению с аналогичным сроком у инфарктных животных. Основным морфологическим критерием является грануляционная ткань, представленная преимущественно сосудами капиллярного типа с полнокровием, разрастанием оформленной соедини­тельной ткани.

Таким образом, развитие острого инфаркта миокарда, вызванного окклюзией коронарной артерии, укладывается в классические сроки, описанные в литературе и совпадает с клиническими данными. Гистологически выявляется усиленное образование сосудов (ангиогенез) в группе животных с введением суспензии ГСК/ПК фракций 1,076 и 1,090.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований отработан метод выделения фракций клеток костного мозга крыс, обогащенных КСК/ПК. Этот метод включает разделение клеток костного мозга с помощью изопикнического центрифугирования на сложных градиентах перкола.

Испытано несколько экспериментальных моделей острого инфаркта миокарда и детально отработана технология получения инфаркта миокарда в эксперименте на крысах путем перевязки левой венечной артерии. Модель инфаркта характеризовалась развитием гистологической картины, характер­ной для данного заболевания у человека.

Отработан способ введения суспензии КСК/ПК в сердечную мышцу, суть которого заключается во введении Зх 105 клеток в объеме 100 мкл в одну точку в районе перевязки артерии сразу после процедуры наложения лигатуры. Такой способ введения позволил снизить летальность животных от процедуры операции до минимума (11%).

Проведены исследования влияния введения трех фракций КСК/ПК с плавучими плотностями 1,076,1,080 и 1,090 г/мл в сердечную мышцу во время моделирования острого инфаркта миокарда на функциональные и гисто-морфологические показатели сердца подопытных животных. Установлено, что наиболее низкая летальность к 21-му дню после инфаркта наблюдалась при введении фракции 1,090 (5%), а наиболее высокая — при введении фракции 1,080 (30%). Летальность животных при введении фракции 1,076 составила 20%.

Гистологическая картина зоны инфаркта во всех трех группах животных к 21-му дню существенно не различалась. Однако в группах 1 и 3 отмечалась интенсивная васкуляризация капиллярного типа, т. е. появление новых эндотелиоцитов, причем в 1-й группе в большей степени, чем в 3-й.

Список литературы

  1. Липовецкий Б.М. Инфаркт, инсульт, внезапная смерть. СПб., 1997. 191 с.

  2. Люсов В.А. Инфаркт миокарда (вчера, сегодня, завтра)// Российский кардиологический журнал. 1999. №1. С. 6—15.

137

  1. Международное руководство по инфаркту миокарда/Под ред. Р.В.Ф. Кэмпбелла М.: Медицина. 1997. 87 с.

  2. PhibbsB. The human heart. New York: P.Press, 1997. P. 272.

  3. Чазов Е.И. Роль нарушений регуляторных механизмов в формировании заболеваний сердечно-сосудистой системы // Тер.архив. 1999. № 9. С. 8—12.

  4. Акмаев И.Г. Взаимодействие основных регулирующих систем (нервной эндокринной, иммунной) и клиническая манифестация их нарушений // Клин.мед. 1997. № 11. С. 8-10.

  5. Скворцов А.А., Пожарская НИ. Роль нейрогормональных систем в патогенезе хронической сердечной недостаточности // Росс.мед.журн. 1999. № 2. С. 56—61.

  6. Комаров Ф.И., ОльбинскаяЛ.И.,Литвщкий П.Ф. и др. Коррекция экстракардиаль-ных влияний на сердце как метод лечения ишемической болезни сердца // Фармакология и токсикология. 1982. № 3. С. 53—59.

  7. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина, 1984. 272 с.

  8. Литвицкш П.Ф., Сандриков В.А., Демуров ЕЛ. и др. Адаптивные и патогенные эффекты реперфузии и реоксигенации миокарда. М.: Медицина, 1994. 280 с.

  9. Комаров Ф.И., Олъбтская Л.И., Литвщкий П. Ф. и др. Коррекция экстракардиаль-ных влияний на сердце как метод лечения ишемической болезни сердца // Фармакология и токсикология. 1982. № 3. С. 53—59.

  10. Олъбинская Л. И., Литвщкий П. Ф. Коронарная и миокардиальная недостаточность. М.: Медицина, 1986. 272 с.

  11. Крыжановский Г.Н. Патология регуляторных механизмов // Пат.физиол. и эксперим.терапия. 1990. № 2. С. 3—8.

  12. Maseri A., Chierchia S., Davies G. Pathaphysiology of coronary occlusion in acute infarction //Circulation. 1986. Vol. 73. N 2. P. 233-239.

  13. OpieL.H. The Heart: Physiology, Metabolism, Pharmacology and Therapy. London: Arune and Stratton, 1984. 391 p.

  14. Виноградов А.В., Дмитриев Г.П., Арутюнов Г.П. и др. Определение массы и скорости образования инфаркта миокарда в реальном масштабе времени // Кардиология. 1988. № 4. С. 24-26.

  15. Ross A.M., Coyne K.S., Moreyra E. et al., for the GUSTO-1 Angiographic Investiga­tors. Extendee mortality benefit of early postinfarction reperfusion//Circulation. 1998. P. 1549-1556.

  16. Руда М.Я. Базовое лечение больных острым инфарктом миокарда // Росс.мед.журн. 1999. № 6. С. 3—8.

  17. Gavagan Т., ReddyMJ. Myocardial Infarction: The First 24 hours //Pharma J. 1997-2"" edition. P. 16—23.

  18. Сумароков А.В., Моисеев B.C. Клиническая кардиология. М.: Универсум Паблишинг, 1996. 248 с.

  19. Шевченко Н.М. Рациональная кардиология. М.: Стар'Ко, 1997. С. 256.

  20. Фармакотерапия сердечно-сосудистых заболеваний / Под ред. Е.И.Чазова. М-Медицина, 2000. 416 с.

  21. Явелов И.С. Современные подходы к раннему лечению острого инфаркт^ миокарда // Росс.мед.журн. 1997. Т. 6. № 2. С. 72—82.

  22. Поминова Н.М. Роль опиоидного тетрапептида в регуляции функциональной активности надпочечников при экспериментальной сердечно-сосудисто» патологии: канд. дисс. Алма-Ата, Томск, 1992. 148 с.

138


  1. Сапронов Н.С., ТоркуновПА., ЕлисеевВ.В. и др. Влияние нового фенилалкильного производного таурина на размер зоны некроза при экспериментальном инфаркте миокарда у крыс // Пат.физиол и эксперим.терапия. 1999. № 4. С. 19—20.

  2. Karagueuzian H.S., Mandel W.J. Электрофизиологические механизмы нарушений ритма желудочков: корреляция экспериментальных и клинических данных // В кн.: Аритмии. / Под ред. W.J. Mandel. M.: Медицина, 1996. Т. 2. С. 256—278.

  3. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко В.А. Клеточная кардио-миопластика //Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. № 2. С. 1-17.

  4. Новиков В.П. Инфаркт миокарда. Патогенез, фармакотерапия, профилактика. М.: Лань, 2000. 336 с.

  5. Болл СДж., Кемпбелл Р.В.Ф., Френсис Г.С. Международное руководство по сердечной недостаточности. М., 1995. 90 с.

  6. Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. Сердечно-сосудистая хирургия. 2001. Болезни и врожденные аномалии системы кровообращения. М.: Изд-во НЦССХ им. Бакулева. 2002. 83 с.

  7. Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Л.: Наука, 1982. 288 с.

  8. Бродский В.Я. Полиплодия в миокарде: компенсаторный резерв в сердце // Бюлл. экспер. биол.и мед. 1995. Т. 199. № 5. С. 454-^459.

  9. Гуриев СБ. Экстрацеллюлярные компоненты сердечной мышцы в процессе повреждения и репарации при экспериментальном инфаркте миокарда: Автореф. дис. 1989. 16 с.

  10. Полежаев Л.В. Факторы регенерации нерегенерирующих органов и тканей // Вестн. РАН. 2000. Т. 70. С. 597-603.

  11. СаркисовД.С Регенерация и ее клиническое значение. М.: Медицина, 1979.284 с.

  12. Дыгай A.M., Шахов В.П. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза. Томск: ТГУ, 1989. 224 с.

  13. Карлов А.В., Шахов В.П. Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики. Томск: STT, 2001. 480 с.

  14. Гольдберг ЕД., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: ТГУ, 1992. 264 с.

  15. Шахов В.П. Дрейфующий медленноразвивающийся каскадоподобный механизм адаптации при действии на организм экстремальных факторов // Бюлл. эксперимент, биологии и медицины. 1996. Т. 121. № 5. С. 571—574.

  16. Анохин ПК. Очерки по физиологии функциональных систем. М.: Медицина, 1975. 448 с.

  17. Маянский Д.Н. Клетки Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. Новосибирск, 1981. 172 с.




  1. Меерсон Ф.З. Адаптация, деадаптация и сердечная недостаточность. М.: Медицина, 1977. 344 с.

  2. Судаков К.В. Новые аспекты классической концепции стресса // Бюлл. экспер. биол. 1997. Т. 123. № 2. С. 124-128.

  3. Makino S., Fukuda К., Mioshi S. et al. Cardiomyocytes can be regeneration from mar­row stromal cells in vitro // J. Clin. Invest. 1999. V. 103. P. 697—705.

  4. Tomita S., Li R.K., Jia Z.Q. et al. Bone marrow cells transplantated in cardiac scar induced cardiomyogenesis and angiogenesis and improved damaged heart function // Circulation. 1999. Vol. 100 (suppl.l). 1-91-1-92.

139

КОНЦЕПЦИЯ ПО ИЗУЧЕНИЮ И ИСПОЛЬЗОВАНИЮ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ

ВВЕДЕНИЕ

Настоящая концепция разработана в соответствии с посланиями Президента Республики Казахстан народу Казахстана от 1 марта 2006 г. "Стратегия вхождения Казахстана в число пятидесяти наиболее конкурентно-способных стран мира", от 18 февраля 2005 г. "Казахстан на пути ускоренной экономической, социальной и политической модернизации", Государственной программой реформирования и развития здравоохранения Республики Казахстан на 2005—2010 гг., утвержденной Указом Президента Республики Казахстан от 13 сентября 2004 г. № 1438.

Разработка настоящей концепции продиктована необходимостью стратегического видения перспектив развития научных разработок и внедрения в практику клеточной терапии в Республике Казахстан.

1. АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В СОВРЕМЕННОЙ МЕДИЦИНЕ

Последние десятилетия в медицине ознаменовались рядом крупнейших достижений молекулярной и клеточной биологии, на базе которых возникли серьезные научно обоснованные предпосылки для разработки и внедрения в практику принципиально новых и эффективных биотехнологических способов профилактики и лечения многих заболеваний человека. В частности, вопрос идет об использовании метода клеточной терапии, когда живые клетки организма являются не только моделью для изучения, но и становятся эффективным средством лечения заболеваний человека и основная цель клеточной терапии заключается в увеличении биологической функции поврежденных тканей или органов. Исследованию в плане перспективы использования заместительной или восстановительной клеточной терапии с применением стволовых клеток должен быть подвергнут широкий спектр приобретенных и наследственных терапевтических и хирургических заболеваний, а также ряд других острых и хронических синдромов и состояний. Идея клеточной терапии с использованием своих или чужих стволовых клеток для лечения заболеваний человека на сегодняшний день уже стала реальностью-Основой клеточной терапии является клеточная трансплантация. Последнюю можно определить как комплекс медицинских мероприятий, при котором на протяжении короткого или длительного времени организм пациента имеет непосредственный контакт с жизнеспособными клетками ауто-, алло-, изо- или ксеногенного происхождения. Рекомендуемый к клиническому применению метод клеточной терапии провозглашает отказ от медикаментоз­ной коррекции биохимического беспорядка в пораженных клетках. Он нацелей на возмещение в органах отсутствующих клонов специализированных клеток, а также на участие трансплантированных клеток в восстановлении функций

140

сохранившихся клеток пораженного органа. В данном случае акцент ставится на мероприятия, направленные на своевременную замену старых, необратимо измененных клеток новыми путем трансплантации пула донорских клеток или путем стимуляции собственного резерва регенерации, а не на "лечение" старых клеток.

Идея использования клеточных трансплантаций выглядит наиболее выгодной по следующим объективным причинам.

В то же время пересадка клеток имеет бесспорные преимущества перед органной трансплантацией и обусловлена:




141

Технически метод клеточной терапии в клинике выполняют тремя способами:

  1. путем непосредственной трансплантации донорских клеток в строго заданные участки поврежденных органов (например, доставка нейрональных клеток с помощью стереотаксической техники) или доставки клеток в,-соответствующие органы током крови (например, при доставке клеток в| целевой орган током крови);

  2. путем дистанционного управления процессами регенерации и пролиферации в поврежденных органах за счет временного размещения донорских клеток в экстракорпоральном контуре перфузионных систем, осуществляющих инкубацию донорских клеток в потоке крове или плазмы больного (например, клеток печени или селезенки);

  3. путем регуляции экзогенными цитокинами и другими факторами активности и пролиферации эндогенных стволовых клеток пациента.

Изучение корригирующих возможностей этих технически различающихся методов клеточной терапии позволило установить ряд общих закономерностей реализации их воздействия на организм:

  1. стабильность, выраженность и длительность лечебного эффекта при использовании клеточных технологий находятся в прямой зависимости от количества паренхимы, сохранившейся в пораженном органе, которая способна отвечать на регуляторные сигналы;

  2. эффективность клеточных трансплантаций зависит от суммарной массы биологической активности используемого донорского материала;

  3. выраженность и длительность функционирования пересаженных клеток зависит от биологической (биохимической) адекватности микроокружения. Поскольку физиологически активные вещества, т. е. сигнальные молекулы микроокружения, определяют возможность реализации генетической программы пересаженных клеток.

Широкие возможности применения стволовых клеток для клеточной заместительной и восстановительной терапии были положительно оценены в США, Англии, Германии, Японии, Китае, Корее, Израиле и ряде других стран. В США, несмотря на существующий до последнего времени запрет на государственную поддержку работ согласно инструкции Национального института здоровья (NIH USA) по выделению стволовых клеток из эмбрионов человека, работа с линиями таких клеток разрешена частным лабораториям и биотехнологическим компаниям, включая разработку методов получения линий клеток человека и их терапевтического использования. Среди них такие пионеры клеточных биотехнологий как, Geron Corporation, Stem Cell Inc. и сотни других. Частный бизнес в США вкладывает в биотехнологические компании и исследовательские институты, занятые исследованиями стволовых клеток, миллиарды долларов.

Влиятельная организация пациентов США (Patients Coalition for Urgent Research, USA), играющая определяющую роль в распределении средств на биомедицинские цели, провела скрининг возможного охвата больных, нуждающихся в клинических технологиях, основанных на использований стволовых клеток человека. Анализ показал, что только по следующим

142

основным группам заболеваний: сердечно-сосудистым, онкологическим, аутоиммунным, диабету, заболеваниям с диффузным поражением печени, остеопорозу, болезням Альцгеймера и Паркинсона и другим заболеваниям нервной системы, а также повреждениям позвоночника, порокам развития число потенциальных пациентов может составлять около 128 млн. человек. Этот список может быть пополнен и теми пациентами, которые имеют глубокие ожоги или раны другой этиологии, для лечения которых также необходимы стволовые клетки.

Таким образом, перечисленные возможности применения клеточных трансплантаций достаточно серьезно обосновывают развитие генеральных направлений научных исследований в республике и позволяют сделать важный вывод о том, что они, несомненно, имеют большие перспективы использования в медицине. Дальнейшее развитие фундаментальных исследований механизмов клеточной дифференцировки и регенерации тканей, создание, разработка новых биомедицинских технологий клеточной терапии должно получить государственную поддержку.

Успешное внедрение в практику экспериментальной медицины методов длительного культивирования стволовых клеток и клеток- предшественников различных тканей животных и человека, выделенных из эмбрионов или клонированных из дефинитивных тканей, полученных из различных тканей взрослых организмов, создали предпосылки разработки технологий заместительной клеточной и тканевой терапии.

В настоящее время развитие клеточной трансплантологии идет в следующих главных направлениях: пересадка специализированных соматических клеток и пересадка стволовых клеток (СК).

Трансплантацию соматических клеток сейчас рассматривают в качестве главной альтернативы пересадке органов. С каждым годом количество больных, нуждающихся по жизненным показаниям в трансплантации печени, почек, сердца, растет во всех странах. Это обусловлено заметным демографическим "старением" населения планеты, увеличением количества хронических заболеваний и появлением экологических болезней. Однако пересадка специализированных соматических клеток пока еще не находит в клинике достаточно широкого применения. В первую очередь это связано с ограни­ченными возможностями как самой трансплантации, так и с качеством и количеством донорской ткани.

Огромный прогресс в медицине был достигнут при использовании терапии стволовыми клетками. Стволовые клетки (СК) (по английски stem cell) — это клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в Другие типы клеток. СК характеризуются наличием трех главных свойств:

  1. ассиметричностью деления, т. е. вместо образования двух одинаковых Дочерних клеток одна из них способна стать более специализированной, а Другая остается неспециализированной;

  2. способностью к самообновлению, т.е. они репопулируют (пролиферация без дифференцировки) на протяжении неопределенно длительного периода Чли даже в течение всей жизни;

  3. дифференцировкой в специализированные типы клеток через стадию

143 I

прогениторных клеток (progenitor— "предшественник") из так называемого краткосрочно существующего пула неспециализированных СК.

По происхождению различают 2 группы СК: эмбриональные (ЭСК) ц региональные (РСК).

ЭСК обычно выделяют из эмбриобласта на 5—7-е сутки развития человеческого зародыша. Так, на 2—4 сутки развития зародыша формируются тотипотентные СК, которые являются истинными СК, способными в условиях in situ развиваться до стадии взрослого организма, т. е. стволовые клетки способны дифференцироваться абсолютно во все типы клеток взрослого организма.

Считается, что ЭСК являются универсальными регуляторами обмена веществ. При попадании тем или иным путем ЭСК в какой-либо орган из них всегда образуются только клетки этого органа, что позволяет их использовать в восстановлении поврежденных органов и тканей, для лечения множества тяжелых заболеваний. Они могут способствовать восстановлению утраченных функций (иммунодефициты, наследственные заболевания) и тормозить неконтролируемые патологические процессы (воспаление, аллергии, онкологические процессы), по запросу организма синтезировать биологически активные вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности. Так, в плацентарных и эмбриональных тканях находится большое количество различных регуляторных веществ, таких, как фактор роста фибробластов, фактор роста нервов, фактор, стимулирующий рост макрофагальных и эритроидных колоний, инсулиноподобный и эндотелиотропный факторы роста. Эти вещества являются мощными агентами, влияющими на собственные клет­ки организма реципиента, корректирующими их функциональное состояние и взаимодействие, что во многих случаях способствует восстановлению их нормальной жизнедеятельности.

В ведущих медицинских центрах мира не прекращаются интенсивные научные исследования условий выращивания бессмертных линий ЭСК и их направленной дифференцировки в различные типы соматических клеток. Технологическая возможность осуществления гениндуцированной селекции ЭСК делает их уникальным потенциальным источником сырья для получения промышленных объемов высокоэффективных очищенных стандартизи­рованных клеточных препаратов. Другими словами, ЭСК представляют собой новый мощный биоресурс медицины.

Однако ЭСК официально не используются в клинической медицине, поскольку имеются серьезные препятствия для их применения и они обусловлены:

144

В случае использования фетальных стволовых клеток, также как и эмбриональных стволовых клеток всплывают серьезные юридические и этические проблемы, поскольку источником их получения является абортивный материал на 18—22 неделе беременности. Кроме того, применение таких клеток чревато развитием осложнений, таких как заражение пациента вирусами, в том числе гепатитом и даже СПИДом, цитомегаловирусом, микоплазмой. Проведение диагностики материала на вирусы и другие инфекции увеличивает себестоимость метода, что в конечном итоге приводит к увеличению стоимости самого лечения.

Безусловно, самым идеальным источником стволовых клеток является плацентарно-пуповинная кровь, собранная после рождения ребенка. Эта кровь относительно богата стволовыми клетками, но общее их количество невелико. Использование пуповинной крови в качестве источника стволовых клеток имеет свои преимущества, во первых, потому, что ее сравнительно легко получить. Во-вторых, что является крайне важным — она идеально подходит ребенку. Получив эту кровь и поместив в криобанк стволовых клеток, в дальнейшем их можно использовать для восстановления практически любых тканей и органов, а также для лечения любых заболеваний, в том числе и онкологических.

Однако действенное применение СК пуповинной крови возможно однократно для самого ребенка до Шлет.

Самым доступным источником РСК, является костный мозг и перифе­рическая кровь человека. Кроме того, ведутся разработки по применению стволовых клеток, полученных из жировой ткани, а также выделенных из слизистой оболочки в районе рецепторов и из других тканей. Наиболее перспективным является использование костного мозга, так как концентрация стволовых клеток в нем самая максимальная. При этом в костном мозге выделяют два вида стволовых клеток: первый — это гематопоэтические стволовые клетки (ГСК), из которых формируются абсолютно все клетки крови, второй—это мезенхимальные стволовые клетки, которые регенерируют практически все органы и ткани. Как правило, используют аспират костного мозга. Другим источником стволовых клеток может являться периферическая кровь. Из периферического кровотока СК можно получить только в том случае, если первоначально их стимулировать к выходу (мобилизация) в периферический кровоток, а затем на специальном оборудовании выделить.

Известно, что с возрастом количество стволовых клеток костного мозга уменьшается. Так, в костном мозге новорожденного на 10 тыс. кроветворных клеток приходится одна стволовая клетка. У подростков стволовых клеток Уже в 10 раз меньше. К 50 годам на полмиллиона обычных клеток приходится лишь одна стволовая, а в возрасте 70 лет всего одна стволовая клетка приходится на миллион кроветворных, соответственно возможности выделения и их использования для регенерации сильно ограничены. При этом весьма остро встает вопрос о специальном оборудовании.

Главными препятствиями на пути внедрения клеточных технологий в Широкую клиническую практику служат два обстоятельства: сохраняющийся Дефицит ауто- и аллогенного донорского клеточного материала с выраженной

145

популяционной активностью и отсутствие убедительных доказательств получения выраженных и пролонгированных клинических эффектов у больных с хроническими и аутоиммунными заболеваниями.

Для решения проблемы нехватки клеточного биоматериала особые надежды возлагаются на расширенное использование ЭСК и РСК. Однако требующиеся высокотехнологические методы получения, сохранения культивирования и стандартизации свойств ЭСК и РСК, а также отсутствие удовлетворительного этико-правового решения проблемы терапевтического клонирования эмбриональных, региональных СК человека во всем мире включая Казахстан, Россию и другие страны, тормозит изучение клинической эффективности применения клеточной терапии. В то же время было бы непростительным для отечественной науки свертывание программ по проведению исследований в этом направлении, тем более, что существующие проблемы входят в разряд разрешимых.

В Республике Казахстан по аналогии с западными странами и Россией назрела серьезная необходимость создания Национальных банков стволовых клеток взрослых, включая стволовые кроветворные клетки, которые можно было по запросу использовать для лечения ряда заболеваний человека.

Для решения такой задачи нужны новые технологии в области культиви­рования СК, полученных из различных источников, основной целью которых должно быть создание оптимальных условий для сохранения морфо-функциональных признаков клеточных трансплантатов, что позволит повысить эффективность клеточной терапии.

Особое внимание следует уделять разработке новых методов или модификации известных методик, направленных на получение стволовых клеток в количестве, достаточном для обеспечения высокой эффективности клеточной терапии. Основу методик должны составлять приемы и подходы, исключающие присутствие в образцах (в том числе в составе сред для культивирования и хранения клеток) токсических компонентов животного или растительного происхождения, а также реагентов, не предназначенных для клинического применения и (или) способных причинить вред здоровью пациента. При разработке методических приемов, направленных на получение конечного продукта клеточной терапии, следует исходить из возможности его использования для лечения как хронических, так и неотложных (острых) состояний и заболеваний. Необходимо установить внутриведомственные стандарты контроля инфекционной, биологической, иммунологической и генетической безопасности полученных стволовых клеток и решить вопросы сертификации препаратов, полученных из стволовых клеток и их дериватов.

Известные случаи клинического применения клеточной терапии в Казах­стане по воле "энтузиастов" в некоторых случаях обгоняют фундаментальные и экспериментальные исследования в этой области, что некоторым образом отрицательно влияет на судьбу всего направления. Именно поэтому разработки в области экспериментального и строгого научного объяснения как вероятных позитивных, так и негативных эффектов клеточной терапии, прежде всего, должны иметь фундаментальный характер. По крайней мере, это поможет решить многочисленные спорные вопросы, связанные не только с обоснова-

146

нием рекомендуемого метода лечения, но и с этической стороной применения различных видов клеточной терапии.

Все мероприятия, начиная с получения материала—источника стволовых клеток до процедуры клеточной терапии, должны проводиться с соблюдением существующих правовых, юридических и этических норм Республики Казахстан, а также других международных нормативных документов и рекомендаций, касающихся этой развивающейся области медицины.

Для биоэтики центральным является принцип "автономии личности пациента, обосновывающий право каждого человека участвовать в качестве самостоятельного субъекта в принятии касающихся лично его жизненно важных медицинских решений. Важнейшее биоэтическое правило добро­вольного информированного согласия призвано на практике обеспечить реализацию принципа автономии личности пациента. Интенсивное развитие исследований биоэтических проблем проведения клинических испытаний на человеке позволило разработать рекомендации, которые предусматривают необходимость контроля независимыми комиссиями или комитетами протоколов таких экспериментов. Ограничено право публикаций их результатов без соответствующей экспертизы первичных материалов в международных журналах. Введены правила GCP (good clinical practice) и GTP (good tissue practice). Результаты изучения биоэтики аккумулированы в Хельсинской декларации всемирной ассоциации врачей (ВМА) 2000 г., международно признанном стандарте проведения научных исследований на человеке. Следующий важный документ—Конвенция Совета Европы (1997) "О защите прав и достоинств человека в связи с применением достижений биологии и медицины". К проблеме трансплантации стволовых клеток прямое отношение имеют все статьи Конвенции. В статье 16 указано, что клеточная терапия с использованием стволовых/прогениторньгх клеток может быть при­менена лишь в случаях, когда традиционные методы хирургического и тера­певтического (альтернативного) лечения не могут гарантировать сохранение жизни или улучшение состояния здоровья пациента, когда риск, которому он подвергается, по меньшей мере, соответствует потенциальной пользе испытания.

Биоэтические комиссии или комитеты входят в состав практически всех международных организаций — ЮНЕСКО, ВОЗ, Совета Европы. Во многих странах создана структурная сеть биоэтических организаций—центральных, региональных и местных (больничных) комитетов по практическому решению вопросов биоэтики. Необходимы они и в Казахстане. На наш взгляд, в клеточной трансплантологии необходимо установить модель взаимоотношения "врач-пациент", которая бы отвечала международным принципам биоэтики.

Однако даже после решения этических, правовых и биотехнологических проблем остается необходимость построения рациональной системы Применения клеточных трансплантаций у больных при разных патологических состояниях. Такая система должна учитывать новейшую информацию о биологии СК и основываться на четких представлениях о механизмах восстановительных процессов с участием СК в поврежденных органах больных. Кроме того, эта система должна строиться с учетом понимания причин

147

угнетения активности собственных РСК и торможения механизмов их естественной дислокации в кровоток и очаги повреждения. Немаловажным обстоятельством является понимание молекулярных механизмов на уровне межклеточных взаимодействий донорских СК с клетками реципиента. В результате, абсолютно незаменимым становится вопрос об определении показаний и противопоказаний к применению различных видов клеточной терапии.

2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ КОНЦЕПЦИИ

Цель настоящей концепции состоит в разработке теоретических, экспериментальных, биотехнологических, экономических и этико-правовых аспектов фундаментальных и прикладных исследований в области изучения стволовых клеток различного происхождения, а также в обосновании принципиальной возможности их использования для профилактики и терапии различных заболеваний.

Реализация этой цели предусматривает решение следующих задач по следующим основным направлениям:

1. Биотехнология стволовых клеток

2. Фундаментальные исследования биологии стволовых клеток

148


3. Доклинические исследования и клинические испытания препаратов стволовых клеток

4. Клиническое применение препаратов стволовых клеток

ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ И МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ КОНЦЕПЦИИ

• Создание Института стволовых клеток в г. Алматы для реализации
основных задач данной концепции.

149

А

ЭТАПЫ РЕАЛИЗАЦИИ ОСНОВНЫХ ПОЛОЖЕНИЙ КОНЦЕПЦИИ

Масштабы проблем, решаемых в рамках Концепции, необходимость координации разрабатываемых мер с возможностями республиканского бюджета обусловливают ее реализацию в два этапа.

На первом этапе (2008—2010 гг.) предполагается решение следующих задач:

150


В области фундаментальных исследований на первом этапе предполагается:




На втором этапе (2009—2011 гг.) предполагается расширить и завершить существующие разработки заместительной и восстановительной клеточной терапии с использованием наиболее перспективных источников стволовых клеток и дать предложения к внедрению разработанных технологий в медицинскую практику. Также будут осуществлены широкомасштабные клинические исследования по обоснованию применения клеточных препаратов в медицинской практике с расширением показаний к применению их в других областях клинической медицины (кардиология, эндокринология, общая терапия, травматология, гастроэнтерология и т.д.)

Создание инфраструктуры исследования стволовых клеток в Казахстане

Одним из важнейших условий реализации Концепции является создание отдельных структурных подразделений (кластера, института, центра, лаборатории). Решение должно приниматься на уровне Правительства РК (Постановление). Предлагается создать Центр в г. Алматы совместно с Центром биологических исследований Министерства образования и науки РК и Институт стволовых клеток (или Научно-практический центр стволовых Клеток). Организационно это будет представлять научное учреждение с инфраструктурой, адаптированной для выполнения конкретных медико-биологических задач по изучению стволовых клеток.

151

ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОТ РЕАЛИЗАЦИИ КОНЦЕПЦИИ

1. Создание инфраструктуры по проведению фундаментальных и
прикладных аспектов исследований в области использования стволовых клеток
различного происхождения.

  1. Получение новых приоритетных данных по биологии стволовых клеток и их роли в поддержании клеточно-тканевого гомеостаза организма.

  2. Разработка методов клеточной терапии различными видами стволовых клеток экспериментальных патологических процессов и состояний, моделирующих заболевания человека (инфаркт миокарда, атеросклероз, гепатиты, циррозы печени, поражения нервной системы и др.).

  3. Изучение ближайших и отдаленных последствий различных видов клеточной терапии в экспериментальных условиях.

  4. Разработка методов получения, типирования стволовых клеток костного мозга, пуповинной и периферической крови, характеризующихся высоким пролиферативным потенциалом и обладающих способностью к дифферен-цировке в клетки различных органов и тканей человека.

  5. Разработка методов получения стандартизованных и трансфецированных стволовых клеток костного мозга, пуповинной и периферической крови, характеризующихся высоким пролиферативным потенциалом и обладающих способностью к дифференцировке в клетки различных органов и тканей человека.

  6. Разработка методов консервации стволовых клеток костного мозга, пуповинной и периферической крови, характеризующихся высоким про­лиферативным потенциалом и обладающих способностью к дифференцировке в клетки различных органов и тканей человека с использованием многокомпо­нентных культуральных сред и различных режимов криоконсервации.




  1. Создание препаратов стволовых клеток из известных источников, которые могут быть рекомендованы после соответствующих клинических испытаний к использованию в терапевтических целях в современной медицинской практике.

  2. Создание необходимой инструктивно-нормативной базы обоснования применения стволовых клеток в медицинской практике.




  1. Создание инфраструктуры оказания медицинской помощи с использо­ванием достижений клеточных технологий приведено в соответствие с имеющимися потребностями и уровнем организационных и медицинских технологий страны.

  2. Разработка отечественных препаратов нового поколения для клеточной терапии, способных восполнить дефицит клеточных технологий при комплексном лечении ряда тяжелых заболеваний.

  3. Применение новых отечественных препаратов для клеточных технологий лечения существенно повысит качество медицинских услуг населению за счет повышения их доступности и меньшей стоимости по сравнению с зарубежными аналогами.

  4. Население практически сможет получить доступ к новьм, а в некоторых случаях (кардиохирургия, онкогематология, наследственные заболевания,

152

иммунодефицита, неврология и др.) жизненно важным лекарственным средствам.

14. Впервые в РК будет внедрен метод современного высокоэффективного
лечения детей с онкогематологическими заболеваниями с использованием
ТКМ, что будет способствовать повышению показателей выживаемости и
снижению смертности детей с данной патологией, первичными иммуноде-
фицитами, наследственными дефектами метаболизма и другими врожденными
и наследственными болезнями (талассемия, нейтропении и др.).

15. Создание банков гемопоэтических стволовых клеток с регистром
доноров, соответствующие международным стандартам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Реализация настоящей Концепции позволит решить многие актуальные проблемы, связанные с фундаментальными и прикладными аспектами использования клеточных технологий для лечения широкого спектра заболеваний человека, разработать на законодательном уровне государ­ственные стандарты и нормативно-инструктивные документы по технологиям выделения, сбора, типирования, хранения, условиям и показаниям к использованию препаратов стволовых клеток в соответствии с требованиями GLP/GMP/GCP/GTP к объектам трансплантации, а также международных стандартов ISO 2000/901 в медицинской практике.

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ОТРАСЛЕВАЯ ПРОГРАММА

РАЗВИТИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ В РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН

СОДЕРЖАНИЕ

  1. Паспорт.

  2. Введение.

  3. Анализ современного состояния.

  4. Цель и задачи программы.

  5. Основные направления и механизм реализации программы.

  6. Необходимые ресурсы и источники финансирования.

  7. Ожидаемые результаты от реализации программы.

  8. Экономический эффект от реализации программы.

  9. Социальный эффект от реализации программы.

10. Научно-технический эффект от реализации программы.

1. Паспорт программы

Название программы Научно-техническая программа

"Развитие клеточных медицинских технологий в Респуб­лике Казахстан" на 2007—2009 гг. (далее Программа) Основание для разработки Послание Президента Республики Казахстан от 1 марта

2006 г. "Стратегия вхождения Казахстана в число пятидесяти наиболее конкурентноспособных стран мира"; Послание Президента Республики Казахстан народу Казах­стана от 18 февраля 2005 г. "Казахстан на пути ускоренной экономической, социальной и политической модер­низации";

Государственная программа реформирования и развития здравоохранения Республики Казахстан на 2005—2010 гг., утвержденная Указом Президента Республики Казахстан от 13 сентября 2004 г. № 1438;

Стратегия индустриально-инновационного развития страны на 2003—2015 гг.;

Закон Республики Казахстан "Об охране здоровья граждан" 7 июля 2006 г.;

Закон Республики Казахстан "О внесении изменений и дополнений в некоторые законодательные акты Республи­ки Казахстан по вопросам здравоохранения" 7 июля 2006 г.

Государственный заказчик Правительство Республики Казахстан программы

Основные разработчики Министерство здравоохранения РК. Национальный

программы научный центр хирургии им. А. Н. Сызганова.

Цель Разработка биологических основ технологии получения и

длительного хранения стволовых клеток из различных ис­точников для клеточной терапии заболеваний человека и внедрение современных клеточных технологий и терапев­тического клонирования в практическое здравоохранение.

154

Задачи I ' Развитие экспериментальных исследований в области кле-

точной биологии стволовых клеток человека и модели­рования заболеваний человека;

• Внедрение клеточных медицинских технологий в
практическое здравоохранение.

Сроки реализации 2007—2012 гг.:

первый этап (2007—2009 гг.) — создание Института клеточ-
ньгх медицинских технологий; дооснащение необходимым
медицинским оборудованием и материалами существующих
научных центров и НИИ; подготовка и обучение кадров;
проведение экспериментальных и доклинических исследова­
ний и клинических испытаний первой фазы.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


Учебный материал
© bib.convdocs.org
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации