Шмелева В.Г. Методы определения активности ферментов. Методические указания - файл n1.doc

Шмелева В.Г. Методы определения активности ферментов. Методические указания
скачать (293.5 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc294kb.15.10.2012 21:59скачать

n1.doc



Министерство общего и профессионального

образования Российской федерации

———

Санкт-Петербургский Государственный

Технологический институт

/Технический университет/

———————————————

Кафедра технологии микробиологического синтеза

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ФЕРМЕНТОВ
Методические указания


Санкт-Петербург

1997

УДК 577.15 + 577.17

Методы определения активности ферментов:

Методические указания. — СПб; 1997. — 42 с.
Содержит описание методов определения активности некоторых ферментов микроорганизмов, которые используются студентами в лабораторном практикуме по спецкурсу “Биохимические основы синтеза аминокислот, пептидов и белков”.
Предназначены для студентов V курса дневного и вечернего факультетов.

Составитель: канд. мед. наук, доцент В.Г.Шмелева
Рецензент: канд. биол. наук, доцент Г.Г.Няникова,

кафедра молекулярной биотехнологии.


Утверждено в качестве методических указаний на заседании методической комиссии II факультета 11.11.96 года.


Рекомендовано к изданию РИСО СпбГТИ (ТУ).

1. Метод определения протеолитической активности.
Метод основан на гидролизе белка казеина препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ).

Протеолитическая активность (ПС) характеризует способность фермента катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 300С превращает в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние казеин в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг); активность выражается в Е/мг белка.

Активность грибных и бактериальных протеиназ определяют при следующих значениях рН:

2,3 - 2,7 - кислые протеиназы

5,3 - 5,7 - кислые протеиназы

7,0 - 7,4 - нейтральные протеиназы

9,3 - 9,7 - щелочные протеиназы
Реактивы:
1. 0,1 М универсальный буферный раствор

Раствор А - 0,1 М раствор уксусной кислоты. 5,7 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор В - 0,1 М раствор фосфорной кислоты. 6,45 мл фосфорной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор С - 0,1 М раствор ортоборной кислоты. 6,18 г ортоборной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор Д - 1 М раствор едкого натра. 40 г едкого натра растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

При смешивании равных объемов растворов А, В и С получают , буферную смесь с рН 1,8. Добавляя к этой смеси 1М раствор едкого натра, получают буферный раствор с нужным значением рН (от 1,8 до 12,0).

2. Рабочий раствор ферментного препарата (рН реакционной смеси 7,0 - 7,4).

0,1 - 1,0 г исследуемого ферментного препарата растворяют в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством 0,1 М универсального буферного раствора с рН 7,2. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят этим же буферным раствором до метки. Последующие разведения производят 0,1 М универсальным буферным раствором с рН 7,2.

3. Раствор субстрата (2% раствор казеина).

2 г казеина растворяют в 90 мл универсального буферного раствора с рН 7,2 (30 мин кипятят на водяной бане),охлаждают. Если рН полученного раствора ниже 7,2, то добавляют по каплям 1 М раствор едкого натра до получения раствора с рН 7,2. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и объем раствора доводят до метки этим же буфером.
Условия проведения ферментативной реакции.
Ферментативный гидролиз проводят при 1%-ной концентрации белка-субстрата в растворе (после смешивания 1 мл раствора субстрата и 1 мл раствора фермента) в течении 10 мин при 30 0С. Перед проведением ферментативной реакции растворы фермента и субстрата следует термостатировать. Для прекращения реакции гидролиза и осаждения непрогидролизованной части субстрата прибавляют 2 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, встряхивают, выдерживают 20 мин при 30 0С и фильтруют. Количество взятого фермента должно быть рассчитано так, чтобы присутствовал большой избыток субстрата и чтобы измеряемые величины оптической плотности при спектроскопировании лежали в области от 0,2 до 0,6 для нейтральных протеиназ.

Определение протеолитической активности проводят при различных разведениях рабочего раствора фермента (5-8 точек).
Порядок проведения работы
По 1 мл субстрата вливают в пять(восемь) пробирок и помещают в термостат при 30 0С. Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 1 мл раствора фермента определенного разведения, пробирки встряхивают и оставляют на гидролиз ровно на 10 мин при 30 0С. Через 10 мин добавляют во все пробирки по 2 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь и для обеспечения полного осаждения выдерживают при 30 0С еще 10 мин. Затем фильтруют через маленькие воронки с бумажными фильтрами в сухие пробирки. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. В фильтрате измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 280 нм против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10мм.

Контрольный опыт готовят прибавляя реактивы в обратной последовательности: к 1 мл ферментного раствора того же раз-ведения, что и в опыте, добавляют 2 мл 5%-ного раствора ТХУ, выдерживают в термостате при 30 0С 10 мин, а затем вносят 1 мл субстрата. Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют.
Построение градуировочной кривой
Для расчета протеолитической активности необходимо построить градуировочную кривую по тирозину. Затем по градуировочной кривой вычислить тирозиновый эквивалент, т.е. ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 мл стандартного раствора. Этот эквивалент необходимо установить для каждого спектрофотометра. Для построения градуировочной кривой готовят раствор тирозина с концентрацией 0,001 М. Для этого 181,19 мг чистого тирозина растворяют в 0,2 М растворе соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л. Из этого исходного раствора готовят растворы тирозина разной концентрации: от 0,02 до 0,3 мкмоль. В сухие кюветы по 3 мл раствора тирозина разной концентрации и определяют оптическую плотность при длине волны 280 нм и толщине поглощающего слоя 10 мм против дистиллированной воды. Следует приготовить растворы из двух навесок тирозина и провести описанным выше способом два параллельных опыта. По средним данным, полученным из двух опытов, строят градуировочную кривую. На оси абсцисс откладывают количество тирозина (с) в мкмоль/мл, на оси ординат - соответствующие значения оптической плотности (Д). Тогда градуировочная кривая будет иметь вид, представленный на рис.1.
Расчет активности
Протеолитическую активность (ПА) в Е/мл ферментного раствора вычисляют по формуле:

Д * Vрс

ПА =------------------------ Е/мл (1),

ТЭ * 10 * Vе
Д - оптическая плотность, измеренная на спектрофотометре

ТЭ - тирозиновый эквивалент, определяемый по градуировочной кривой, мкмоль/мл

10 - время гидролиза субстрата, мин

Vе - объем ферментного раствора, взятого для гидролиза

Vрс - объем реакционной среды после добавления ТХУ
Т.о., по этой формуле находят активность 1 мл ферментного раствора для 5 - 8 разведений рабочего раствора фермента. Далее определяют содержание белка в исходном рабочем растворе фермента (по методу Лоури) и рассчитывают содержание белка в 5 - 8 разведениях фермента. Строят график зависимости активности фермента (скорости реакции) от концентрации белка в растворе. На оси абсцисс откладывают содержание белка в растворе (мг/мл), а на оси ординат - соответствующую протеолитическую активность (Е/мл).




Выявив содержание белка, при котором скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента в реакционной среде, вычисляют удельную активность:
ПА уд = ПА / с Е/мг (2),
с - количество белка (в мг) в 1 мл ферментного раствора, взятого для протеолиза
2. Метод определения протеолитической активности окрашенных растворов.
При определении протеолитической активности ферментных препаратов, имеющих окраску, после осаждения ТХУ может получиться окрашенный фильтрат. В этом случае определение продуктов гидролиза казеина проводится с реактивом Фолина.
Порядок проведения работы
Заполнение проб проводят как в работе 1. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 2 мл 5%-ного раствора ТХУ, смесь перемешивают, выдерживают для обеспечения полного осаждения непрогидролизованного белка и фильтруют. Отбирают 1 мл окрашенного фильтрата, добавляют 5 мл 0,5 М Na23 и 1 мл реактива Фолина (разведение 1:3), выдерживают 20 мин в темноте и фотометрируют при 670 нм против контрольной пробы

в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы в обратной последовательности: к 1мл ферментного раствора того же разведения, как в опыте, добавляют 2 мл 5%-ного раствора ТХУ, а затем вносят 1 мл субстрата. Через 10 мин нахождения в термостате раствор фильтруют.
Построение градуировочной кривой
Для расчета протеолитической активности строят градуировочную кривую по тирозину. Готовят раствор тирозина концентрации 1*10-3 М. Для этого 181,19 мг чистого тирозина растворяют в 0,2 М растворе соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л. Из этого исходного раствора готовят растворы тирозина разной концентрации: от 2*10-4 до 8*10-4. В пробирки наливают по 1 мл раствора тирозина разной концентрации. Добавляют 5 мл 0,5 М Na23 и 1 мл рабочего раствора Фолина, выдерживают 20 мин в темноте и фотометрируют при 670 нм против контроля. В контрольную пробу вместо тирозина наливают 1 мл дистиллированной воды. По полученным данным строят градуировочную кривую (см. рис. 1), по которой определяют молярный коэффициент экстинкции тирозина в мкмоль/мл.

Расчет активности проводят по уравнениям 1 и 2.

3. Метод определения амилолитической активности (АС).
Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы.

Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата (или на 1 мг белка).

За единицу активности амилолитического фермента (АС) принято такое количество фермента, которое в строго определенных условиях температуры, рН и времени действия катализирует до декстринов различной молекулярной массы 1 г растворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.
Реактивы.

  1. Приготовление 1%-ного раствора крахмала (субстрат). 1 г крахмала помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 25 мл воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 мл воды, помещают колбу в кипящую водяную баню, непрерывно перемешивая до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 мл ацетатного буферного раствора рН 4,7 и доводят объём жидкости до метки дистиллированной водой. Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

  1. Приготовление ацетатного буферного раствора с рН 4,7.

Раствор А - 1 М раствор уксусной кислоты. 58 мл ледяной уксусной кислоты наливают в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор Б - 1 М раствор уксуснокислого натрия. 82 г уксуснокислого натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Ацетатный буферный раствор с рН 4,7 готовят смешиванием равных объемов растворов А и Б. Проверяют значение рН на рН-метре.


  1. Приготовление 0,1 М раствора соляной кислоты. 8,2 мл соляной кислоты наливают в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой.

  2. Приготовление основного раствора йода. 0,5 г йода и 5 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в малом количестве воды. Содержимое осторожно перемешивают при плотно закрытой крышке бюкса. После полного растворения йода раствор переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 200 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор хранят в темноте и используют в течение 1 месяца.

  3. Приготовление рабочего раствора йода. 2 мл основного раствора йода разводят 0,1 М раствором соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 100 мл. Перед применением рабочего раствора проверяют на фотоэлектроколориметре его оптическую плотность, пользуясь светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 453 нм и толщине пропускающего слоя 1 см. Оптическая плотность раствора йода должна составлять 0,21 - 0,23. В случае отклонения оптической плотности раствора от этой величины ее приводят к необходимой, добавляя несколько капель кислоты или основного раствора йода.

  4. Приготовление основного раствора ферментного препарата. 0,1 г исследуемого препарата взвешивают в стаканчике вместимостью 25 - 30 мл. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и при необходимости фильтруют. Раствор ферментного препарата может храниться в течение 1 суток при температуре от +0,2 до -4 0С.

  5. Приготовление рабочего раствора ферментного препарата. Рабочий раствор фермента готовят из основного раствора, разбавляя его так, чтобы в 5 мл рабочего раствора содержалось такое количество фермента, которое обеспечивает в принятых условиях гидролиз крахмала от 20 до 70%. Для этого берут различные количества основного раствора в зависимости от активности исследуемого препарата и разбавляют водой до 50 мл (при испытании препарата с активностью от 20 до 700 ед/г) и до 200 мл (при активности от 700 ед/г и выше). Количество основного раствора препарата, которое необходимо взять для приготовления рабочего раствора фермента, находят по таблице 1.


Порядок проведения работы.
В 2 пробирки наливают по 5 мл 1%-ного раствора крахмала, ставят в термостат с температурой 30 0С и выдерживают 5 - 10 мин. Не вынимая пробирки из термостата, наливают в первую пробирку 2,5 мл дистиллированной воды (контрольная), а во вторую - 2,5 мл ферментного раствора (опытная). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в термостате 10 мин. Через 10 мин из контрольного и опытного растворов отбирают по 0,25 мл и переносят в одну из колб с предварительно налитыми 25 мл рабочего раствора йода. Содержимое колб перемешивают. Полученные растворы приобретают следующую окраску: контрольный синюю, опытный - фиолетовую различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала.
Таблица 1


Амилолитическая активность (АС) препарата, ед/г (предполагаемая)

Количество препарата в 5 мл рабочего раствора мг

Количество основного р-ра необходимое для вторичного разбавления,мл

Общий объем разбавленного раствора, мл

от 20 до 80

5,0

50

50

от 80 до 150

2,0

20

50

от 150 до 300

1,0

10

50

от 300 до 700

0,5

5

50

от 700 до 1200

0,25

10

50

от 1200 до 2500

0,125

5

200

от 2500 до 5000

0,05

2

200

свыше 5000

0,025

1

200


Непосредственно после смешивания растворов определяют их оптическую плотность на ФЭК с максимумом светопоглощения 656 нм, пользуясь кюветами с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Контрольным раствором при колориметрировании является дистиллированная вода. Оптическая плотность контрольного раствора (Д1) соответствует количеству исходного субстрата -крахмала. Оптическая плотность опытного раствора (Д2) соответствует количеству крахмала, оставшегося после действия фермента. Разница между значениями оптических плотностей соответствует прогидролизованному количеству крахмала.
Расчет активности
Количество прогидролизованного крахмала (С) в граммах определяют по формуле:
С =( Д1 - Д2)*0,05/ Д1 (3),
где

Д1 - оптическая плотность контрольного раствора;

Д2 - оптическая плотность опытного раствора;

0,05 - количество крахмала, взятое для испытания в качестве субстрата, г
Если количество прогидролизованного крахмала меньше 0,02 или больше 0,04 г, испытание повторяют. При приготовлении рабочего раствора фермента берут большее или меньшее количество исходного раствора для разбавления.

Амилолитическую активность в ед/г препарата бактериального происхождения (АС) определяют по формуле:
АС = (5,885 * С + 0,001671)*1000/n (4.),

где:

С - количество прогидролизованного крахмала, г;

n - количество ферментного препарата, взятое для испытания, мг;

1000 - коэффициент пересчета мг в г;

5,885 и 0,001671 -коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости количества прогидролизованного крахмала от количества фермента, взятого для испытания. В коэффициенты введен множитель для пересчета на 1 час действия фермента.
4. Метод определения активности инвертазы

(-фруктофуранозидазы)
Метод основан на гидролизе дисахарида сахарозы препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента изменением значения рН в щелочную область. За единицу активности инвертазы (КФ 3.2.1.26) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 0С катализирует гидролиз 1 мкмоля сахарозы. Образующиеся в ходе гидролиза сахара (глюкозу и фруктозу) определяют по методу Шомоджи-Нельсона.
Реактивы :
Ледяная уксусная кислота ГОСТ 61-75

Натрий уксуснокислый ГОСТ 199-78

Сахароза ГОСТ 5833-75

Натрий углекислый ГОСТ 84-76

Медь сернокислая ГОСТ 4165-78

Сегнетова соль

Натрий сернокислый безводный

Бикарбонат натрия

Аммоний молибденовокислый

Кислота серная

1. Приготовление ацетатного буфера 0,2 М рН 4,6.

Раствор А - 0,2 М раствор уксусной кислоты. 11,6 мл ледяной уксусной кислоты наливают в мерную колбу и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.

Раствор В - 0,2М раствор уксуснокислого натрия. 26,61 г уксуснокислого натрия растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л. Ацетатный буферный раствор готовят смешиванием 510 мл раствора А и 490 мл раствора В.

2. Приготовление 0,05 М ацетатного буфера рН 4,6 250 мл 0.2М ацетатного буфера растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1л.
3. Раствор сахарозы 7 г сахарозы растворяют в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,6 и доводят объем до 100 мл.

4. 2М раствор безводного углекислого натрия. 212 г углекислого натрия вносят в мерную колбу на 1 л и доводят объем до метки дистиллированной водой.
5. Приготовление реактива Шомоджи

Раствор 1. 24 г углекислого натрия и 12 г сегнетовой соли растворяют в 250 мл дистиллированной воды, затем вливают при перемешивании 40 мл 10%-ного раствора сернокислой меди и после этого добавляют 16 г натрия углекислого кислого (пищевой соды).

Раствор 2. 18 г безводного сернокислого натрия растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды и кипятят 40 мин для удаления углекислого газа, затем охлаждают.

Реактив Шомоджи готовят смешиванием раствора 1 и раствора 2 в колбе вместимостью 1 л и доведением объема до метки дистиллированной водой. При стоянии в течение нескольких дней или недель в реактиве появляется осадок меди, который следует отфильтровать. Раствор хранят в темной посуде с хорошей пробкой.
6. Приготовление реактива Нельсона. 25 г молибденовокислого аммония помещают в колбу вместимостью 500 мл, добавляют примерно 400 мл дистиллированной воды, 21 мл концентрированной серной кислоты и 25 мл 12%-ного мышьяковокислого натрия и доводят водой до метки. Перед употреблением раствор выдерживают 24 - 48 час при 37 0 С.

Условия проведения ферментативной реакции
Ферментативный гидролиз проводят при 7%-ной концентрации субстрата (сахарозы) в течение 5 - 15 мин при 300С. Перед проведением гидролиза раствор субстрата следует термостатировать. Необходимое время гидролиза устанавливается опытным путем. При этом степень гидролиза сахарозы не должна превышать 20 %.
Порядок проведения работы.
В 4 пробирки вносят по 0,6 мл 7%-ного раствора сахарозы, 0,2 мл 0,05М ацетатного буфера и помещают в термостат при 300С. Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 0,2 мл исследуемого ферментного раствора и сразу же в первую пробирку добавляют 4 мл 2М раствора соды; во вторую

пробирку раствор соды добавляют после 5-минутной инкубации, в третью - 10-минутной, а в четвертую - после 15-минутной инкубации.

В полученных гидролизатах определяют содержание инвертного сахара. Для этого из опытных пробирок отбирают по 1 мл исследуемого раствора в другие пробирки, добавляют по 1 мл реактива Шомоджи и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробирки охлаждают и добавляют в них по 1 мл реактива Нельсона. Пробирки тщательно перемешивают и добавляют в каждую по 7 мл дистиллированной воды. Пробы перемешивают в течение 20 мин, затем колориметрируют на ФЭКе при длине волны 595 нм (фильтр №5) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм.

Построение градуировочной кривой
Для расчета инвертазной активности необходимо построить градуировочную кривую зависимости оптической плотности (Д595) от количества инвертного сахара в пробе. Для этого готовят стандартный раствор инвертного сахара. Для этого 1 г сахарозы растворяют в 100 мл воды. 25 мл этого раствора вносят в колбу емкостью 100 мл, добавляют 15 мл 1 М раствора

соляной кислоты. Далее проводят гидролиз в течение 5 мин при 700С. После гидролиза раствор быстро охлаждают, доводят рН до 7, добавляя 2М раствор соды и доводят объем до метки водой. Приготовление проб для построения градуировочной кривой проводят по схеме (табл.2), для этого разводят раствор гидролизата сахарозы в 50 раз и получают раствор сахаров с концентрацией 0,05 мг/мл.

Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, охлаждают и добавляют по 1,0 мл реактива Нельсона. Тщательно перемешивают, добавляют по 7 мл дистиллированной воды. Пробы перемешивают в течение 20 мин и колориметрируют при длине волны 595 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм.
Расчет активности
Инвертазную активность в ед/мг вычисляют по формуле:
А = (М2 - М1)*5*1000/0,2*t*с*м.в., где (5.),

М2- количество сахаров в 1 мл пробы после инкубации, мг

М1 - количество сахаров в 1 мл холостой пробы, мг

0,2 - объем ферментного препарата в мл

5 - разбавление по ходу определения

t - время инкубации, мин

с - концентрация белка в 1 мл ферментного препарата, мг/мл

м.в. - молекулярная масса сахаров

1000 - перевод в микромоли.

Таблица2.

Схема приготовления проб

для построения градуировочной кривой по сахарозе

Количество сахарозы в пробе, мкг

Стандартный раствор гидролизата сахарозы мл

Вода, мл

Реактив Шомоджи мл

15

0,3

0,7

1

25

0,5

0,5

1

35

0,7

0,3

1

40

0,8

0,2

1

50

1,0

-

1


5.1. Методы определения активности фосфатаз.
Фосфатазы являются фосфомоноэстеразами, которые катализируют гидролиз фосфоэфирной связи с выходом неорганического ортофосфата согласно следующему уравнению

OH

/ фосфатаза

R - O - P = O + H2O ------------ > R - OH + H3PO4 (6)

\ Mg2+

OH
Kислая фосфатаза катализирует гидролиз монофосфатов в кислой среде, оптимум рН около 5. В качестве субстратов для кислых фосфатаз используются -глицерофосфат, нитрофенилфосфат и другие эфиры фосфорной кислоты.
5. Определение активности кислой фосфатазы

по -глицерофосфату.

CH2OH CH2OH

/ фосфатаза /

CH - O - PO3H2 + H2O ------------ > CHOH + H3PO4 (7)

\ Mg2+ \

CH2OH CH2OH


Метод основан на гидролизе субстрата -глицерофосфата препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента трихлоруксусной кислотой и количественном определении неорганического фосфата, освободившегося в ходе гидролиза.

За единицу активности фермента (Е) принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в минуту при заданных условиях определения. Активность кислой фосфатазы выражают числом микромолей неорганического фосфата, отщепившихся от -глицерофосфата за 1 мин при 30 0С. Удельную активность выражают числом единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка в ферментном препарате.
Реактивы.
1. Ацетатный буфер 0,2 М, содержащий 0,05 М хлористого магния, рН 5,4

Раствор А - 0,2 М раствор уксусной кислоты. 11,55 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор Б - 0,2 М раствор уксуснокислого натрия. 27,22 г уксуснокислого натрия растворяют в воде и доводят объем до 1 л.

0,2 М ацетатный буфер рН 5,4 готовится смешением трех объемов раствора А и семи объемов раствора Б и добавлением 10,15 г хлористого магния.

2. Раствор -глицерофосфата натрия 0,02 М. 0,612 г -глицерофосфата натрия растворяют в мерной колбе на 100 мл в небольшом количестве дистиллированной воды. Убедившись в полноте растворения доводят дистиллированной водой до метки.

3. Реактивы для определения фосфора:

5%-ный раствор молибдата аммония.

5 г молибдата аммония растворяют в воде в мерной колбе на 100 мл.

5 М раствор серной кислоты.

К 520 мл дистиллированной воды добавляют 200 мл концентрированной серной кислоты. 24%-ный раствор хлористого олова в концентрированной соляной кислоте. 2,4 г хлористого олова растворяют в 10 мл концентрированной соляной кислоты.

Реактив А готовят смешением 4 мл 5%-ного раствора молибдата аммония, 4 мл 5 М раствора серной кислоты и 8 мл дистиллированной воды.

Реактив В готовят растворением 24 мг аскорбиновой кислоты в 12 мл дистиллированной воды и добавлением 0,1 мл 24%-ного раствора хлористого олова.

Реактивы А и В готовят в день опыта.
Условия проведения ферментативной реакции

Ферментативный гидролиз проводят при 0,004 М концентрации -глицерофосфата в реакционной смеси в течение 20 мин при 30 0С. Перед проведением ферментативной реакции раствор фермента следует термостатировать. Начало гидролиза фиксируется после добавления раствора субстрата. Для прекращения реакции гидролиза прибавляют 12%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, в количестве половины объема реакционной смеси. Количество взятого фермента должно быть рассчитано так, чтобы субстрат присутствовал в избытке и чтобы за время инкубации происходило расщепление 30 - 40 % субстрата. О скорости протекания ферментативной реакции и степени превращения -глицерофосфата судят по количеству освобождающегося неорганического фосфата.


Порядок проведения работы
В 3 пробирки наливают по 0,5 мл ацетатного буфера рН 5,4 и помещают в термостат при 30 0С, затем во все пробирки наливают по 0,3 мл раствора исследуемого ферментного препарата, оптимальная концентрация которого предварительно была определена при различных разведениях фермента (5 - 10 точек). Затем в 2 пробирки добавляют по 0,2 мл субстрата и фиксируют время начала ферментативной реакции. Инкубацию проводят при 30 0C 20 мин. После инкубации в 2 опытные пробирки добавляют 0,5 мл 12%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Третья пробирка является контрольной: к раствору фермента в буфере добавляют 0,5 мл 12%-ного раствора ТХУ, а затем 0,2 мл субстрата и инкубируют вместе с опытными пробирками. Все пробы центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин.

Из надосадочной жидкости отбирают две параллельных пробы по 0,2 мл для определения содержания неорганического фосфора.
Определение неорганического фосфора
Принцип метода заключается во взаимодействии неорганического фосфора с молибденовокислым аммонием с образованием комплекса фосфорномолибденовокислого аммония. Эта соль в присутствии восстановителя превращается в смесь окислов молибдена различной валентности, так называемую молибденовую синь, интенсивность окраски которой колориметрируют при длине волны 720 нм.
Порядок проведения работы
К 0,2 мл надосадочной жидкости приливают 1,8 мл дистиллированной воды, 1,6 мл реактива А (раствор молибдата аммония в серной кислоте), хорошо перемешивают, добавляют 0,4 мл реактива В (аскорбиновая кислота в кислом растворе хлористого олова) и быстро перемешивают. Для развития окраски

пробы оставляют при комнатной температуре на 30 мин и фотометрируют при длине волны 720 нм против контроля. Расчет содержания неорганического фосфора в исследуемых пробах ведут по калибровочной кривой.
Построение калибровочной кривой для определения фосфора
Для расчета активности фермента необходимо построить калибровочную кривую по фосфору. Активность фермента определяют путем спектрофотометрического измерения неорганического фосфата.

Для построения калибровочной кривой готовят раствор калия фосфорнокислого однозамещенного. 54,5 мг калия фосфорнокислого однозамещенного, высушенного до постоянного веса растворяют в мерной колбе на 200 мл в дистиллированной воде.

В 1 мл полученного раствора будет содержаться 62 мкг фосфора. При последующем разведении этого раствора в 10 раз в 1 мл будет содержаться 6,2 мкг фосфора. Этот раствор служит рабочим для построения калибровочного графика.


Таблица 3

Заполнение проб для построения калибровочного графика

по фосфору


пробы

мкг фосфора в пробе

рабочий раствор мл

вода мл

реактив А мл

реактив В мл

1

0.62

0.1

1.9

1.6

0.4

2

1.24

002

1.8

1.6

0.4

3

1.86

0.3

1.7

1.6

0.4

4

2.48

0.4

1.6

1.6

0.4

5

3.10

0.5

1.5

1.6

0.4

6

3.72

0.6

1.4

1.6

0.4

7

4.34

0.7

1.3

1.6

0.4

8

4.96

0.8

1.2

1.6

0.4

9

5.56

0.9

1.1

1.6

0.4

10

6.20

1.0

1.0

1.6

0.4

K

-

-

2,0

1.6

0.4


Интенсивность окраски измеряется на колориметре при длине волны 720 нм против контрольной пробы. Следует приготовить растворы из двух навесок калия фосфорнокислого однозамещенного и провести описанным выше способом 2 параллельных опыта. По средним данным, полученным из двух опытов строится градуировочная кривая. На оси абсцисс откладывают количество мкг фосфора в пробе (с), на оси ординат - соответствующее значение оптической плотности (Д).
Расчет активности фермента
Фосфатазную активность Е/мг вычисляют по формуле:
А = М*1,5 / 0,2*0,3*t*м.в.*с, где (8)
М - количество фосфора в 0,2 мл инкубационной среды, найденное по градуировочной кривой (мкг);

0,2 - объем пробы для анализа фосфора (мл);

1,5 - объем инкубационной среды (мл);

0,3 - объем ферментного препарата (мл);

м.в.- молекулярная масса фосфора;

t - время инкубации (мин);

с - концентрация белка в мл ферментного препарата (мг).
5.2. Определение активности кислой фосфатазы

по p-нитрофенилфосфату.
Метод основан на гидролизе субстрата p-нитрофенилфосфата исследуемым препаратом кислой фосфатазы с последующей инактивацией фермента изменением значения рН в щелочную область и количественном определении освободившегося p-нитрофенола.
Активность кислой фосфатазы выражают числом микромолей p-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза p-нитрофенилфосфата, или, иначе, числом микромолей субстрата, расщепившегося за 1 мин при 30 0С.

Условия ферментативной реакции
Реакция гидролиза p-нитрофенилфосфата начинается после добавления субстрата в термостатированную при 30 0С инкубационную среду, содержащую ферментный препарат в буферном растворе при рН 4,0 , и прекращается при сильном изменении рН в щелочную область после добавления NаОН.

Реактивы
1. 0,2 М ацетатный буфер рН 3,8 - 4,0

2. 1 М едкий натр

3. p-нитрофенилфосфат 0,038 М

4. Рабочий раствор фермента
Порядок проведения работы
В две пробирки наливают по 1,6 мл ацетатного буфера 0,2 М рН 4,0, пробирки термостатируют при 30 0С 10 мин, добавляют 0,2 мл раствора ферментного препарата, перемешивают и добавляют 0,2 мл 0,038 М раствора субстрата. Пробирки инкубируют 15 мин при 300С. Ферментативную реакцию гидролиза останавливают добавлением 1 мл 1 М раствора едкого натра. В контрольную пробирку наливают буфер - 1,6 мл, субстрат - 0,2 мл, инкубируют 15 мин, добавляют 1 мл щелочи и в конце добавляют 0,2 мл фермента.

Опытные пробы спектрофотометрируют против контрольной при длине волны 405 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм.

Определение количества освободившегося р-нитрофенола проводят по калибровочной кривой (рис.2)

Расчет активности проводится по формуле:
Таблица 4

Заполнение проб для построения калибровочного графика

по р-нитрофенолу


N пробы

рабочий раствор мл

ацетатный буфер, рН

NаОН мл

Концентрация р-нитрофенола мкМ/мл

Д405

1

0,1

1,9

1,0

0,0066




2

0,2

1,8

1,0

0,0133




3

0,3

1,7

1,0

0,0200




4

0,4

1,6

1,0

0,0266




5

0,5

1,5

1,0

0,0330








Ауд = Д*3 / 0,2*МЭ*с*t, где (10)
Д - оптическая плотность при длине волны 405 нм;

0,2- объем ферментного раствора, мл;

3 - объем инкубационной среды, мл;

МЭ - молярный коэффициент экстинкции р-нитрофенола, рассчитанный по калибровочной крив

ой, мкмоль/мл;

с - концентрация белка в 1 мл ферментного раствора, мг/мл;

t - время инкубации, мин
Построение калибровочной кривой
Для расчета фосфатазной активности по р-нитрофенилфосфату необходимо построить калибровочную кривую по р-нитрофенолу и вычислить по ней молярный коэффициент экстинкции, то есть оптическую плотность раствора, содержащего 1 М р-нитрофенола в 1 л стандартного раствора или 1 мкмоль/мл. Этот коэффициент необходимо установить для каждого спектрофотометра.

Для этого готовят исходный раствор р-нитрофенола с концентрацией 0,139 мг/мл (1 мкМ/мл). Рабочий раствор с концентрацией 0,2 мкМ/мл готовят разбавлением исходного в 5 раз. Схема заполнения проб для построения калибровочного графика представлена в таблице 4
5.3. Определение активности кислой фосфатазы

по фенолфталеинфосфату.
Метод основан на гидролизе субстрата фенолфталеинфосфата препаратом фосфатазы с последующей инактивацией фермента изменением значения рН в щелочную область и количественном определении освободившегося фенолфталеина. Активность фермента выражают числом микромолей фенолфталеина, отщепившегося в процессе ферментативного гидролиза фенолфталеинфосфата, или иначе числом микромолей субстрата, расщепившегося за 1 мин при температуре 300С.
Реактивы


  1. Ацетатный буфер 0,1 М, рН 3.8 - 4,0

  2. Едкий натр 1 М

  3. Исходный 10 %-ный раствор фенолфталеинфосфата натрия в аммонийном буфере.


Рабочий раствор субстрата готовят разбавлением исходного раствора в 50 раз 0,1 М ацетатным буфером рН 4,0. При этом получают 0,2 %-ный (0,0036 М) раствор субстрата в аммонийно-ацетатном буфере
Условия гидролиза
Реакция гидролиза фенолфталеинфосфата натрия начинается сразу после добавления в него ферментного препарата и прекращается после добавления 1М раствора NаОН. Ферментативный гидролиз проводят при 0,0012М концентрации фенолфталеинфосфата в реакционной смеси в течение 15 мин при 300С.
Порядок проведения работы
В две пробирки наливают по 2 мл рабочего раствора субстрата, добавляют по 1 мл исследуемого раствора фермента инкубируют в течение 15 мин при 3О0С. По истечении времени инкубации в пробы добавляют по 1 мл 1 М раствора NаОН и колориметрируют против контроля при длине волны 540 нм в кюветах толщиной 5 мм. Контролем является выдержанная в течение срока инкубации пробирка с 2 мл субстрата, в которую после термостатирования добавляют 1 мл 1 М раствора NаОН и 1 мл ферментного раствора.


Расчет активности фермента
Фосфатазную активность Е/мг вычисляют по формуле:


Ауд = Д*Vинк.ср. / МЭ*Vе*t*c, где (11)
Д - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 540 нм

МЭ - молярный коэффициент экстинкции фенолфталеина, рассчитанный по калибровочной кривой (рис.3), мкмоль/мл

Vе - объем ферментного раствора, мл

Vинк.ср.- объем инкубационной среды после добавления 1М NаОН, мл

t - время инкубации, мин

с - концентрация белка в 1 мл ферментного раствора, мг/мл
Построение калибровочной кривой
Для расчета фосфатазной активности по фенолфталеинфосфату необходимо построить калибровочную кривую по фенолфталеину и вычислить молярный коэффициент экстинкции, то есть оптическую плотность, которую дал бы 1 Моль фенолфталеина в 1 л стандартного раствора, или 1 мкМоль в мл. Этот коэффициент необходимо установить для каждого колориметра. Для этого

растворяют 50 мг фенолфталеина в 50 мл спирта и доводят водой до метки в мерной колбе емкостью 100 мл. Разбавлением этого исходного раствора готовят рабочий раствор с концентрацией фенолфталеина 0,2 мг/мл (0,628 мкМоль/мл). Схема заполнения проб для построения калибровочного графика представлена в табл.5
Следует приготовить растворы из двух навесок фенолфталеина и провести описанным выше способом два параллельных опыта. По средним данным, полученным из двух опытов, строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают количество фенолфталеина в мкмоль/мл, а на оси ординат - соответствующее значение оптической плотности. Затем по градуировочной

кривой рассчитывают молярный коэффициент экстинкции, который используют в формуле (11).

Таблица 5

Заполнение проб для построения калибровочного графика

по фенолфталеину


N пробы

Рабочий раствор мл

Вода

NаОН мл

Концентрация фенолфталеина

мкМоль/мл

Д540

1

2,0

1,0

1,0

0,310




2

1,5

1,5

1,0

0,240




3

1,0

2,0

1,0

0,157




4

0,5

2,5

1,0

0,079




5

0,4

2,6

1,0

0,062




6

0,3

2,7

1,0

0,031




7

0,2

2,8

1,0

0,016







5.4 Определение активности щелочной фосфатазы

по р-нитрофенилфосфату.
Метод основан на гидролизе субстрата р-нитрофенилфосфата в щелочной среде исследуемым препаратом фосфатазы и количественном определении освободившегося р-нитрофенола (уравнение 9).

Активность щелочной фосфатазы выражают числом микромолей р-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза р-нитрофенилфосфата или, иначе, числом микромолей субстрата, расщепившегося за 1 мин при комнатной температуре.
Условия ферментативной реакции
Реакция гидролиза р-нитрофенилфосфата начинается сразу после добавления субстрата в термостатированную при 30 0С инкубационную среду, содержащую ферментный препарат в 0,05 М глицериновом буфере (рН 10,6). О ходе ферментативной реакции судят по изменению поглощения при 400 нм.
Реактивы


  1. Глициновый буфер 0,05 М рН 10,6;

  2. р-нитрофенилфосфат 0,038 М;

  3. Рабочий раствор фермента.


Порядок проведения работы
В кювету наливают 2,2 мл буферного раствора, добавляют 0,5 мл ферментного препарата, перемешивают и добавляют 0,3 мл 0,038 М раствора субстрата. В контрольную кювету налива наливают 2,5 мл буфера и 0,5 мл ферментного раствора. Перемешивают и измеряют против контрольной кюветы увеличение оптической кой плотности при 400 нм в течение 20 - 30 мин.
Расчет удельной активности проводят по формуле:


Ауд = Д*3 / 0,5*МЭ*t*c, где (12)
Д - изменение оптической плотности при 400 нм за время t;

0,5 - объем ферментного препарата, мл;

3 - объем инкубационной среды, мл;

МЭ - коэффициент молярной экстинкции р-нитрофенола (см. работу 1.6), мкмоль/мл

с - содержание белка в 1 мл ферментного препарата, мг/мл;

t - время инкубации, мин.
6. Метод определения активности -галактозидазы
-галактозидаза (лактаза) катализирует гидролиз 1-4-глюкозидной связи в -галактозидоглюкозе (лактозе) на галактозу и глюкозу. Поскольку сама лактоза и продукты ее гидролиза обладают восстановительными свойствами, определение активности -галактозидазы по скорости расщепления природного субстрата, т.е. по количеству образующихся моносахаридов (как, например, при определении активности инвертазы) не представляется возможным. Поэтому об активности -галактозидазы судят по скорости расщепления синтетического субстрата 2-нитрофенил--Д-галактопиранозида, являющегося аналогом лактозы и отличающегося от нее наличием нитрофенола вместо глюкозы. Реакция, катализируемая -галактозидазой, протекает по уравнению:

Активность в-галактозидазы выражают числом микромолей р-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза субстрата за за 1 мин при 30 0С.
Условия проведения ферментативной реакции
Ферментативный гидролиз проводят при 0,001 М концентрации субстрата в инкубационной среде в течение 20 мин при 300С. Перед проведением ферментативной реакции раствор фермента в фосфатном буфере следует термостатировать. Время начала гидролиза фиксируют после добавления раствора субстрата. В процессе реакции освобождается р-нитрофенол, окрашивающий раствор в желтый цвет. Для прекращения реакции гидролиза добавляется 0,5 мл сильнощелочного раствора карбоната натрия. Количество взятого фермента должно быть рассчитано так, чтобы субстрат присутствовал в избытке и чтобы измеряемые величины оптической плотности при спектроскопировании лежали в области 0,3 - 0,4.
Реактивы


  1. 0,1 М фосфатный буфер рН 7,0

Раствор А - 0,2 М раствор Na2HPO4. 35,81 г Na2HPO4 растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

Раствор Б - 0,2 М раствор NaH2PO4*2Н2O, 3,12 г NaH2PO4*2Н2O растворяют в 100 мл дистиллированной воды. 435 мл раствора А и 65 мл раствора Б смешивают в колбе объемом 1 л и доводят водой до метки.

2. 0,01 М раствор р-нитрофенил--Д-галактозида (М.м. 301,26). Раствор субстрата готовят в день опыта в объеме, определяемом задачей эксперимента.

3. Рабочий раствор фермента готовят разведением основного раствора фермента так, чтобы степень гидролиза субстрата за 20 мин инкубации не превышала 50 %. Основной раствор разводится 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0.

4. 2 М раствор Na2CO3. 212 г безводного углекислого натрия взвешивают на технических весах, переносят в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем дистиллированной водой до метки.
Порядок проведения работы
В 3 пробирки вливают по 2,6 мл раствора 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, в 2 опытных пробирки добавляют по 1 мл рабочего раствора фермента и помещают в термостат. Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 0,4 мл раствора субстрата - нитрофенилгалактопиранозида, перемешивают и инкубируют 20 мин при 30 0С. Через 20 мин во все 3 пробирки наливают по 0,5 мл 2М раствора карбоната натрия, а в третью (контрольную) пробирку наливают 1 мл рабочего раствора ферментного препарата. В опытных пробирках определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 405 нм против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Для определения количества освободившегося р-нитрофенола используют градуировочную кривую по р-нитрофенолу (рис.2)

Расчет удельной активности в-галактозидазы проводят по формуле:
Ауд = Д*Vинк.ср. / MЭ*Ve*t*c, где (13)
Д - оптическая плотность, измеренная на спектрофотометре при 405 нм;

МЭ - молярный коэффициент экстинкции, определяемый по калибровочной кривой (рис.2), мкмоль/мл;

Vинк.ср.- объем инкубационной среды, мл

Vе - объем ферментного раствора, мл

t - время гидролиза, мин

с - содержание белка в 1 мл ферментного препарата, взятого для гидролиза, мг
ЛИТЕРАТУРА


1. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М.: Высшая школа,1981,с.272.
2. ГОСТ 20264.2-74. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности.
3. ГОСТ 20264.4-74. Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности.


СОДЕРЖАНИЕ

1. Метод определения протеолитической активности 3

2. Метод определения протеолитической активности

окрашенных растворов 9

3. Метод определения амилолитической активности 11

4. Метод определения активности инвертазы

(в-фруктофуранозидазы) 16

5. Методы определения активности фосфатаз 22

5.1. Определение активности кислой фосфатазы

по -глицерофосфату 22

5.2. Определение активности кислой фосфатазы по

р-нитрофенилфосфату 28

5.3. Определение активности кислой фосфатазы по

фенолфталеинфосфату 32

5.4. Определение активности щелочной фосфатазы

р-нитрофенилфосфату 36

6. Метод определения активности в-галактозидазы 38

Литература 42



Учебный материал
© bib.convdocs.org
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации